DB22-T2984-2019-鹿粘膜病雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法-吉林省

ICS11.220DB22B41吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2984—2019鹿粘膜病雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法DoubleantibodysandwichELISAmethodforthedetectionofdeermucosaldisease吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T2984—2019前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：長(zhǎng)春市乾藝生物科技研究所、長(zhǎng)春市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：田來(lái)明、趙春梅、張宇、李男、田桂華、申雨弘、崔鶴馨、權(quán)心嬌、胡桂英、付曉霞、王雨千。IDB22/T2984—2019鹿粘膜病雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法警示——使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安全問(wèn)題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，具體防護(hù)措施及要求按照GB19489執(zhí)行。1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鹿粘膜病雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的術(shù)語(yǔ)和定義、試劑、儀器設(shè)備、樣品處理、操作步驟和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鹿粘膜病病毒的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求由病毒性腹瀉病毒（mucosaldiseasevirus，MDV）引起的鹿傳染病，可引起鹿呈多臨床表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為腹瀉、母鹿流產(chǎn)、不孕，產(chǎn)死胎、木乃伊胎或畸形胎等。除有特殊說(shuō)明外，所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。4.1PBS，見(jiàn)表A.1。4.5pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液，見(jiàn)表A.5。4.6底物溶液（OPD-H2O2），見(jiàn)表A.6。4.7終止液，見(jiàn)表A.7。4.10MDV免疫球蛋白，見(jiàn)附錄B。1DB22/T2984—20194.11MDV酶標(biāo)抗體，見(jiàn)附錄C。5儀器設(shè)備5.1離心機(jī)，最高轉(zhuǎn)速15000r/min。5.2恒溫培養(yǎng)箱，溫度均勻度≤±1（37℃時(shí)）5.3酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀。5.4紫外分光光度計(jì)，200nm～1000nm。6樣品處理6.1樣品采集選擇新鮮鹿糞3g～5g裝入潔凈的食品塑料袋內(nèi)，用封口機(jī)封口或結(jié)扎緊袋口后立即放入盛有冰塊的保溫瓶（箱）內(nèi)。每份樣品的包裝瓶（袋）上均要貼上標(biāo)簽，寫明采集地點(diǎn)，編號(hào)，時(shí)間等。如暫時(shí)不進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)－80℃保存。6.2樣品處理取1g采集到的鹿糞樣品加入10mLPBS（5.1）中充分混勻，3000r/min離心（6.1）30min，上清液即為待檢樣品。7.2在ELISA反應(yīng)板中加入用包被液（5.2）稀釋至1.0mg/mLMDV免疫球蛋白（5.10）100μL/孔，37℃（6.2）包被4h。7.3棄去板中溶液，加洗滌液（5.3）300μL/孔，輕微晃動(dòng)反應(yīng)板，3min后棄去洗滌液；如此操作3次，最后將ELISA反應(yīng)板置于吸水紙上輕輕拍干。7.6加入待檢樣品100μL/孔，并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（5.8）2孔，陰性對(duì)照（5.9）2孔，空白對(duì)照1孔，密封ELISA反應(yīng)板，37℃孵育2h。7.8加入酶標(biāo)抗體（5.11）100μL/孔，密封ELISA反應(yīng)板，37℃孵育1h。7.9重復(fù)7.3的操作。2DB22/T2984—20198.4樣品OD值/陰性對(duì)照平均OD值≥2判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。3DB22/T2984—2019附錄A（規(guī)范性附錄）相關(guān)試劑的配制PBSpH7.4配制見(jiàn)表A.1。表A.1NaCl8.0gKH2PO41.2g2.9gNa2HPO4?12H2OKCI0.2g蒸餾水加至1000mL包被液配制見(jiàn)表A.2。表A.24DB22/T2984—2019封閉液配制見(jiàn)表A.4。表A.4兔血清白蛋白5g洗滌液100mLpH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液配制見(jiàn)表A.5。表A.50.2mol/LNa2HPO40.1mol/L檸檬酸蒸餾水25.7mL24.3mL50mL底物溶液（OPD-H2O2）配制見(jiàn)表A.6。表A.6pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液鄰苯二胺5DB22/T2984—2019附錄B（規(guī)范性附錄）MDV免疫球蛋白提取MDV免疫球蛋白提取步驟為：a)取20mLMD高免血清，加20mLpH7.4的PBS，使其稀釋1倍；b)在攪拌條件下緩慢加入40mL的飽和硫酸銨（50%飽和度），4℃放置0.5h～1h；以3000r/min離心20min，棄去上清液；c)d)加入20mLPBS，將沉淀充分溶解后再加入10mL飽和硫酸銨（即33%飽和度），進(jìn)行第二次沉淀；e)重復(fù)B.4二次，使沉淀物達(dá)到完全白色為止；f)沉淀物溶于2mL～4mLPBS中，裝入透析袋中密封；g)再將其放到盛有PBS的容器中，于4℃條件下透析過(guò)夜脫鹽；h)再用SephadexG-25進(jìn)行過(guò)柱純化；i)收集純化免疫球蛋白，將其用蔗糖濃縮后采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，IgG含量為1.28mg/mL；j)進(jìn)行分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?DB22/T2984—2019CA附錄C（規(guī)范性附錄）MDV酶標(biāo)抗體MDV酶標(biāo)抗體的標(biāo)記步驟為：a)取10mgHRP溶于1.0mL蒸餾水，加入新鮮配制的0.06mol/L高碘酸鈉水溶液1.0mL，混勻后置冰箱4℃30min；b)將其取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液1.0mL，于室溫放置30min后加入含10mg純化MDIgG水溶液2.0mL；c)將上述結(jié)合物混勻后裝入透析袋中在0.05mol/LpH9.5的碳酸緩沖液中緩慢攪拌透析6h使之結(jié)合，然后吸出；d)再將吸出物加5mg/mL硼氫化鈉溶液0.4mL，4℃放置2h；e)將上述結(jié)合物混合液加入等體積的飽和硫酸銨，4℃放置30min后，以3000r/min離心20min，沉淀物溶于少許0.02mol/LpH7.4的PBS中，透析過(guò)夜；f)再將其在4℃條件下1.5×104r/min離心2