DB22-T2563-2016-甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)Real-timePCR法-吉林省

ICS07.100DB22C04吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2563—2016甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)Real-timePCR法Real-timePCRmethodforthedetectionofH1N1Influenzavirusnucleicacid吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2563—2016前言本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林省疾病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：柳鴻敏、李靜、吳東林、臧?；?。IDB22/T2563—2016甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)Real-timePCR法警示——使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安全問(wèn)題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國(guó)家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)Real-timePCR法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于甲型H1N1流感病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求WS/T230-2002臨床診斷中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用WS285-2008流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)3.1試劑3.1.1水：無(wú)菌RNaseFreeWaterRNA提取試劑：RNA提取試劑盒一步法反應(yīng)試劑盒1DB22/T2563—2016a)SWH1-Forward：5’-GGGTAGCCCCATTGCAT-3’b)SWH1-Reverse：5’-AGAGTGATTCACACTCTGGATTTC-3’c)SWH1-Probe：FAM5’-TGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGG-3’BHQ14儀器和設(shè)備4.1漩渦振蕩器4.2Real-timePCR儀：配相應(yīng)的反應(yīng)管4.3高速離心機(jī)：8000rpm～12000rpm4.4冷藏冰箱：2℃～8℃4.5冷凍冰箱：-20℃4.6生物安全柜：CLASS-Ⅱ型4.7微量移液器：10μL，100μL，200μL，1000μL5試驗(yàn)步驟5.1標(biāo)本5.1.1鼻拭子將拭子（3.1.4）平行于上顎插入鼻孔，旋轉(zhuǎn)，保持?jǐn)?shù)秒，待拭子頭吸收分泌物以后，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出。將拭子頭浸入病毒采樣液（3.1.4）中，棄去拭子尾部，待檢。5.1.2咽拭子用拭子（3.1.4）適度用力擦拭雙側(cè)扁桃體及咽后壁后，將拭子頭浸入病毒采樣液（3.1.4）中，棄去拭子尾部，待檢。將上述標(biāo)本用漩渦振蕩器（4.1）充分混勻后，取0.2mL的病毒采樣液置于無(wú)菌管中，按照RNA提取試劑盒（3.1.2）的要求提取甲型H1N1流感病毒核酸。提取后的病毒核酸放置2℃～8℃冰箱（4.4）中，如不能及時(shí)檢測(cè)，放置-20℃冰箱（4.5）中冷凍保存。引物配制：新合成的引物開(kāi)蓋前用高速離心機(jī)（4.3）短暫離心15s。用水（3.1.1）溶解，加水量為10×引物的nmol數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物濃度為100μmol/L。將100μmol/L的引物2.5倍稀釋，此時(shí)濃度為40μmol/L。探針配制：新合成的探針開(kāi)蓋前用高速離心機(jī)（4.3）短暫離心15s。用水（3.1.1）溶解，加水量為10×引物的nmol數(shù)，充分混勻，此時(shí)濃度為100μmol/L。將100μmol/L的探針5倍稀釋，此時(shí)濃度為20μmol/L。2DB22/T2563—201625μL反應(yīng)體系：2×RT-PCRBuffer12.5μL，25×RT-PCREnzymeMix1μL，40μmol/L的上、下游引物各0.5μL，20μmol/L的探針0.5μL，RNA模板5μL，用水（3.1.1）補(bǔ)足至25μL。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照和試劑對(duì)照。5.3.3Real-timePCR反應(yīng)條件將上述加好模板的反應(yīng)管混勻，短暫離心后放入Real-timePCR儀（4.2）進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：45℃逆轉(zhuǎn)錄10min；95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火45s，40個(gè)循環(huán)。在60℃退火時(shí)收集熒光信號(hào)。6結(jié)果判讀6.1結(jié)果判定流感病毒A型核酸與甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)均為陽(yáng)性，則判斷為標(biāo)本陽(yáng)性。如只有流感病毒A型核酸檢測(cè)為陽(yáng)性，甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)為陰性，則判斷為甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)陰性，建議做流感病毒A型的其他型別檢測(cè)。如流感病毒A型核酸檢測(cè)為陰性，甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)為陽(yáng)性，則考慮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中有甲型H1N1流感病毒核酸污染，建議重新進(jìn)行試驗(yàn)。陰性對(duì)照反應(yīng)得到的熒光曲線不應(yīng)超過(guò)閾值線，應(yīng)無(wú)Ct值或?yàn)镃t值為零。如果陰性對(duì)照出現(xiàn)Ct值，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程受到污染，此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)該嚴(yán)格按照操作程序重復(fù)實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，且Ct值在20～30之間。如果陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果未達(dá)到要求，則需嚴(yán)格按照操作程序重復(fù)試驗(yàn)。當(dāng)所有對(duì)照成立，檢測(cè)標(biāo)本在35個(gè)循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)熒光信號(hào)，且呈現(xiàn)典型S擴(kuò)增曲線，則判斷為甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性；若Ct值在35～40之間，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，如Ct值還在35～40之間，可