實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 呼腸孤病毒Ⅲ型檢驗(yàn)方法 征求意見稿

2GB/T14926.25—202X本文件規(guī)定了呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo3）的檢測(cè)方法。本文件適用于小鼠、大鼠、地鼠和豚鼠及其相關(guān)產(chǎn)品、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境樣本、動(dòng)物源性生物制品中Reo3的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.50實(shí)驗(yàn)動(dòng)物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)GB/T14926.51實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫酶試驗(yàn)GB/T14926.52實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫熒光試驗(yàn)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3原理3.1抗體檢測(cè)原理根據(jù)免疫學(xué)原理，采用Reo3抗原檢測(cè)小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠血清中Reo3抗體。3.2核酸檢測(cè)原理根據(jù)Reo3病毒S3蛋白基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物和一條特異性探針，探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，淬滅作用消失，熒光信號(hào)產(chǎn)生并被檢測(cè)儀器接受，隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物與熒光信號(hào)的增長(zhǎng)呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。從而通過識(shí)別熒光信號(hào)對(duì)樣本中的Reo3核酸進(jìn)行檢測(cè)。4主要試劑和器材4.1試劑：4.1.1ELISA抗原3GB/T14926.25—202X4.1.1.1特異性抗原Reo3病毒感染BSC-1或BHK21細(xì)胞，當(dāng)病變達(dá)+++～++++時(shí)，收獲培養(yǎng)物。凍融三次或超聲波處理后，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清液再經(jīng)超速離心濃縮后制成ELISA抗原。4.1.2正常抗原BSC-1或BHK21細(xì)胞凍融破碎后，經(jīng)低速離心去除細(xì)胞碎片而獲得的上清液。4.1.3抗原片Reo3病毒感染BHK21細(xì)胞，培養(yǎng)4~5天，病變達(dá)++～+++時(shí)用胰酶消化分散，PBS洗滌，涂片。室溫干燥的同時(shí)，在紫外線下20cm處照30分鐘。冷丙酮固定10分鐘，-20℃保存。4.1.4陽性血清Reo3病毒抗原免疫SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠所獲得的抗血清。4.1.5陰性血清SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清。4.1.6酶結(jié)合物辣根過氧化物酶標(biāo)記羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠IgG抗體，用于檢測(cè)相應(yīng)動(dòng)物血清抗體。辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌蛋白A（SPA）可用于小鼠、豚鼠、地鼠血清抗體的檢查。4.1.7異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠IgG抗體，用于檢測(cè)相應(yīng)動(dòng)物血清抗體。4.1.8核酸檢測(cè)試劑4.1.8.1經(jīng)DEPC處理的無RNA酶水或商品無RNA酶水。4.1.8.2市售RNA抽提試劑。4.1.8.3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR基礎(chǔ)反應(yīng)液：市售商品化試劑4.1.8.4陽性對(duì)照：為滅活的含有Reo3病毒核酸的組織樣本或細(xì)胞培養(yǎng)物。4.1.8.5陰性對(duì)照為不含Reo3病毒核酸的組織樣本或細(xì)胞培養(yǎng)物。4.1.8.6引物和探針：根據(jù)表1的序列合成引物和探針，引物和探針配制成10μmol/L儲(chǔ)備液，-20℃保存。4GB/T14926.25—202X表1：實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增引物和探針注：探針也可選用具有與FAM和BHQ-1熒光基團(tuán)相同檢測(cè)效果的其他合適的熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基4.2器材4.2.1酶標(biāo)儀。4.2.2熒光顯微鏡。4.2.3普通顯微鏡。4.2.437℃培養(yǎng)箱或水浴箱。4.2.5實(shí)時(shí)熒光PCR儀。4.2.6高速冷凍離心機(jī)。4.2.7普通離心機(jī)。4.2.8組織勻漿器。4.2.9生物安全柜。4.2.10PCR超凈工作臺(tái)。4.2.11微量移液器（0.1~2μL，1~10μL，10~100μL，100~1000μL）。4.2.12無RNase的離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL1mL），無RNase的PCR擴(kuò)增反應(yīng)管（0.2mL，八連管或96孔板）。4.2.13采樣工具：剪刀、鑷子和滅菌棉拭子等。5檢測(cè)方法5.1生物安全措施實(shí)驗(yàn)操作及處理按照GB19489的規(guī)定，由具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進(jìn)行相應(yīng)操作。5.2采用ELISA方法（見GB/T14926.50—2001）進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，或使用經(jīng)驗(yàn)證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。5.3采用IFA方法（見GB/T14926.52—2001）進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，或使用經(jīng)驗(yàn)證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。5GB/T14926.25—202X5.4采用IEA方法（見GB/T14926.51—2001）進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，或使用經(jīng)驗(yàn)證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。5.5采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法（見附錄A）進(jìn)行Reo3病毒核酸檢測(cè)，或使用經(jīng)驗(yàn)證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。6結(jié)果判定6.1抗體檢測(cè)結(jié)果判定對(duì)陽性或可疑結(jié)果，選用同一種抗體檢測(cè)方法或另一種抗體檢測(cè)方法復(fù)測(cè)。如仍為陽性則判為陽性。6.2核酸檢測(cè)結(jié)果判定對(duì)陽性或可疑結(jié)果，用同一種核酸檢測(cè)方法復(fù)測(cè)，或取可疑陽性樣本PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)定，如仍為陽性，則判為陽性。7結(jié)果報(bào)告根據(jù)判定結(jié)果，作出報(bào)告。6GB/T14926.25—202X（規(guī)范性附錄）呼腸孤病毒Ⅲ型核酸檢測(cè)方法A.1采樣及樣本的處理采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣本前處理過程中須戴一次性手套A.1.1臟器組織活體動(dòng)物采用安樂死方法進(jìn)行處死，剖檢，無菌采集動(dòng)物的腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和腸，待檢樣品按照5倍比例加入滅菌PBS，充分勻漿，離心取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌離心管中，編號(hào)備用。A.1.2盲腸內(nèi)容物或糞便無菌采集動(dòng)物盲腸內(nèi)容物或糞便，按照5倍比例加入滅菌PBS，充分勻漿，離心取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌離心管中，編號(hào)備用。A.1.3細(xì)胞培養(yǎng)物將樣品樣本接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融三次，細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移于15mL離心管中，12000r/min離心10min，去細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到無菌15mL離心管中，編號(hào)備用。A.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境樣本A.1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料、墊料和飲水取適量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料和墊料置于聚乙烯薄膜袋中，加入10倍體積滅菌PBS（飼料和墊料需全部浸泡于液體中）。密封后浸泡5~10min，充分混勻，將混懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，4℃,12,000rpm離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號(hào)備用。取適量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水直接轉(zhuǎn)移到無菌5mL離心管中，編號(hào)備用。A.1.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備用滅菌棉拭子拭取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備出風(fēng)口初效濾膜表面沉積物，將拭子置入滅菌15mL離心管，加入適量滅菌PBS，浸泡5~10min，充分混勻，取出棉拭子，將離心管于4℃,12,000rpm離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號(hào)備用。A.1.5樣本的存放采集或處理的樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h，若需長(zhǎng)期保存，須放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。A.2病毒核酸提取7GB/T14926.25—202X選擇市售商品化RNA提取試劑盒。按照試劑盒操作說明書提取樣品中的RNA。在提取RNA時(shí)應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對(duì)照樣品，按同樣方法提取RNA。RNA的提取操作應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，避免RNA氣溶膠的污染。制備好的RNA應(yīng)盡快進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)，若暫時(shí)不能進(jìn)行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。A.3實(shí)時(shí)熒光RT-PCRA.3.1反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)計(jì)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，其中陽性對(duì)照以含有Reo3的組織或細(xì)胞培養(yǎng)物提取的RNA作為陽性對(duì)照模板，其中陰性對(duì)照以不含有Reo3的RNA樣品（可以是正常動(dòng)物組織或正常細(xì)胞培養(yǎng)物）作為陰性對(duì)照模板，空白對(duì)照即為不加模即在反應(yīng)中用水來代替模板。表2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系配制表11215A.3.2反應(yīng)參數(shù)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)見表3：表3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)8GB/T14926.25—202X否11是試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。A.4實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果判定A.4.1結(jié)果分析和條件設(shè)定R直接讀取檢測(cè)結(jié)果，基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品樣本擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。A.4.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)A.4.2.1空白對(duì)照無Ct值，并且無熒光擴(kuò)增曲線。A.4.2.2陰性對(duì)照無Ct值，并且無熒光擴(kuò)增曲線。A.4.2.3陽性對(duì)照Ct值應(yīng)≤35，并且有明顯的熒光擴(kuò)增曲線，則表明反應(yīng)體系運(yùn)行正常，否則此次試驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR擴(kuò)增。A.4.3結(jié)果判定A.4.3.1若待檢樣品無熒光擴(kuò)增曲線，則判定樣品Reo3病毒核酸陰性。A.4.3.2若待檢樣品有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35時(shí)，則判定樣品中Reo3病毒核酸陽性。A.4.3.3若待檢樣品Ct值介于35和40之間時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。重新檢測(cè)后，若Ct值≥40時(shí)，則判定樣品Reo3病毒核酸陰性