實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠腦脊髓炎病毒檢測(cè)方法 編制說(shuō)明

《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠腦脊髓炎病毒檢測(cè)方法》GB14926.26修訂編制說(shuō)明2025年2月，標(biāo)準(zhǔn)編制組在北京召開線下會(huì)議，就標(biāo)準(zhǔn)的編制格式做了統(tǒng)一部依據(jù)工作分工，廣東省生物技術(shù)研究院（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)中心）主持小鼠腦脊髓炎病毒是我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中SPF級(jí)以上小鼠必須排除的病原項(xiàng)目。1994年，國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布實(shí)施實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，第一次1994版中給出了4種TMEV檢測(cè)方法，2001版修定時(shí)檢測(cè)方法未作改動(dòng)，僅對(duì)成為我國(guó)國(guó)家及省級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)的主腦脊髓炎病毒核酸檢測(cè)方法研究。所建立的TMEV核酸檢測(cè)方法與小鼠肝炎病兩種方法診斷TMEV感染結(jié)果一致。兩種檢測(cè)方法吻合系數(shù)Kappa=0.605在2017年發(fā)布實(shí)施，實(shí)施以來(lái)已被實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)方法》T/CALAS26-2017為基礎(chǔ)，將TMEV核酸檢測(cè)方法加入到國(guó)標(biāo)修訂內(nèi)1.科學(xué)性原則。在尊重科學(xué)、親身實(shí)踐、調(diào)查研究的基礎(chǔ)上2.可操作性原則。本標(biāo)準(zhǔn)無(wú)論是從樣品采集，處理，RNA抽提，PCR反應(yīng)，均3.協(xié)調(diào)性原則。以切實(shí)提高我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠腦脊髓炎病毒檢測(cè)技術(shù)水平為核b.刪除原規(guī)范性引用文件中的年號(hào)，并新增血凝抑制試驗(yàn)及核酸檢測(cè)規(guī)范性引六、主要試驗(yàn)或驗(yàn)證的分析、綜述報(bào)告，技注：探針也可選用具有與FAM和BHQ-1熒光基團(tuán)相同檢測(cè)效果的其他合適濃度（0.05~0.5μM）進(jìn)行優(yōu)化，以反應(yīng)的前3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)為熒光本底信號(hào)，通過(guò)比較Ct值和熒光強(qiáng)度增加值(絕對(duì)熒光強(qiáng)度與背景熒光強(qiáng)度的差值，濃度組織樣本核酸不同品牌試劑擴(kuò)展產(chǎn)物Ct值一致，所有試劑均可得到很好的TAKARAPROMEGATiangenAbi對(duì)TMEV、RCV、KRV、H-1、MNV、MHV、SV、PVM、Reo-3、HV、LCMV、MVM、Ect、Poly、Mad和MCMV的RNA和cDNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果除TMEV為陽(yáng)性外，其他病毒均為陰性，表明建立的方法具有良好的特異性（圖2）。將TMEV-質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋，進(jìn)行qPCR測(cè)試，標(biāo)準(zhǔn)品在1×1圖310倍系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的熒光定量擴(kuò)增曲線1-8：1×109copies/μL至1×102copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品，9：1×101copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品，10，無(wú)模板對(duì)照表2標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值樣品名稱拷貝數(shù)TMEV強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品19標(biāo)準(zhǔn)品28標(biāo)準(zhǔn)品37標(biāo)準(zhǔn)品46標(biāo)準(zhǔn)品55標(biāo)準(zhǔn)品64標(biāo)準(zhǔn)品7標(biāo)準(zhǔn)品8標(biāo)準(zhǔn)品90樣本進(jìn)行梯度稀釋，對(duì)組織樣本檢測(cè)的靈敏度為35copies/μL（圖4）依據(jù)上述測(cè)試結(jié)果，將本方法的判定標(biāo)準(zhǔn)確定為：（1）若待檢樣品無(wú)熒光擴(kuò)增曲線，則判定樣品TMEV病毒核酸陰性。（2）若待檢樣品有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35時(shí)，則判斷樣品TMEV病毒核酸陽(yáng)性。（3）若待檢樣品Ct值介于35和40之間時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。重新檢測(cè)后，若Ct值≥40時(shí)，則判定樣品TMEV病毒核酸陰性。重新檢測(cè)后的Ct值仍介于35和40之間，則判定樣品TMEV病毒核酸可疑陽(yáng)性，需進(jìn)一步進(jìn)行序列測(cè)定。中檢出率最高，其次是腦和肝臟，小鼠脾臟、心臟、肺臟、腎臟和胃也可檢出表3TMEV病毒在自然感染小鼠臟器中的分布器官糞便盲腸內(nèi)容物腦脾臟肝臟心臟肺臟胃感染率68/16從表中可知2010年~2015年廣東地區(qū)SPF級(jí)小鼠TMEV核酸陽(yáng)樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果顯示三個(gè)樣本擴(kuò)增的基因序列相同，均為84bp。表4小鼠TMEV核酸陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)樣本類型年份或設(shè)施樣本數(shù)陽(yáng)性樣本數(shù)合計(jì)（%）SPF級(jí)小鼠2010201120124938727.35開放環(huán)境飼養(yǎng)小鼠野生褐家鼠201320142015設(shè)施A設(shè)施B/295131277368753.66統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.868說(shuō)明兩種方法診斷TMEV感染結(jié)果一致。兩種檢測(cè)方+-+-組織的《2019年度實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原