體外放射分析技術(shù)課件

第六章體外放射分析技術(shù)

Invitroradioassay山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院體外放射分析技術(shù)體外分析發(fā)展史體外放射分析技術(shù)Yalow

Berson

體外放射分析技術(shù)一、定義以放射性核素或其他非放射性物質(zhì)標(biāo)記的配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結(jié)合體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進行的微量生物活性物質(zhì)的檢測技術(shù)。體外放射分析技術(shù)二、分類:體外分析技術(shù)體外放射分析體外非放射分析放射性競爭結(jié)合分析放射性非競爭結(jié)合分析放射免疫分析

(radioimmunoassay,

RIA)免疫放射分析(immunoradiometricassay,

IRMA)酶免疫分析(EIA)化學(xué)發(fā)光免疫分析

(CLIA)

熒光免疫分析(FIA)體外放射分析技術(shù)

放射免疫分析

radioimmunoassay,RIA體外放射分析技術(shù)一、RIA的基本原理（一）競爭抑制結(jié)合反應(yīng)：放射免疫分析是在體外條件下，由足量的非標(biāo)記抗原（Ag）與定量的標(biāo)記抗原（*Ag）對限量的特異性抗體（Ab）的競爭抑制結(jié)合反應(yīng)。體外放射分析技術(shù)分析原理*Ag+AbAg+*Ag-Ab+*AgAg-Ab+Ag條件：*Ag與Ag免疫活性相同*Ag與Ab恒量*Ag與Ag總量大于Ab有效結(jié)合位點體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)Ag*與Ag由于免疫化學(xué)性質(zhì)一致，共同競爭性與Ab結(jié)合，當(dāng)Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*與Ag之和大于Ab時，則Ag*-Ab復(fù)合物的形成受Ag含量的制約，二者之間存在竟?fàn)幰种频暮瘮?shù)關(guān)系，即隨著Ag濃度的增加，Ag*-Ab復(fù)合物就減少，因為Ag*對Ab的結(jié)合被Ag競爭性抑制。根據(jù)這一函數(shù)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求出被測抗原的含量體外放射分析技術(shù)（二）劑量反應(yīng)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)記物與被測物之間的函數(shù)關(guān)系可以用劑量反應(yīng)曲線來表示。劑量反應(yīng)曲線是用一系列標(biāo)準(zhǔn)抗原反應(yīng)而繪制出來的，所以又叫標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)抗原(標(biāo)準(zhǔn)品)是廠家在試劑盒中提供的已知劑量的非標(biāo)記抗原。體外放射分析技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原和一定量的標(biāo)記抗原在一定條件下同限量的特異性抗體進行反應(yīng)；在反應(yīng)達到平衡后，利用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法分離B和F；分別測量B和F的放射性；用反應(yīng)變量（如B/F）作為縱坐標(biāo)，反應(yīng)劑量作為橫坐標(biāo)（即一系列標(biāo)準(zhǔn)抗原）作一條曲線，就得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原對反應(yīng)變量的競爭抑制曲線，這就是劑量反應(yīng)曲線。體外放射分析技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線體外放射分析技術(shù)二、RIA的基本步驟：實驗由兩部分組成：1.標(biāo)準(zhǔn)曲線：用一系列濃度遞增的標(biāo)準(zhǔn)品（oAg），在嚴(yán)格相同的條件下同*Ag競爭與Ab結(jié)合反應(yīng)，以oAg的劑量為橫坐標(biāo)，*Ag.Ab結(jié)合率（B%）為縱坐標(biāo)制得刻度曲線（Calibrationcurve）；2.樣本測定：同等條件下，待測樣本可獲得一定的B%，由此可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得待測物（oAg）的含量。體外放射分析技術(shù)三、質(zhì)量控制(QualityControl):目的：為了獲得準(zhǔn)確可靠的測定結(jié)果

室間：某一地區(qū)/全國性機構(gòu)就一些分析項目質(zhì)控對各實驗室所得結(jié)果進行統(tǒng)計比較室內(nèi)：實驗室內(nèi)部對每次分析結(jié)果的質(zhì)量進行檢查和控制

誤差：

A.隨機誤差(RandomError)：

放射性測量的統(tǒng)計誤差不可避免，呈高斯分

實驗操作的實驗誤差

布，以精密度評價

試劑配制等

B.系統(tǒng)誤差(SystematicError)：通過努力可以消除

由某一固定因素引起，儀器、試劑、操作程序、試驗方法等

體外放射分析技術(shù)主要優(yōu)點：

生物制劑，穩(wěn)定性受多種因素影響，需有質(zhì)量控制措施（QualityControl)

靈敏度高：可達10-9―10-12g(mol)

特異性強：抗原抗體結(jié)合具有很高的特異性

應(yīng)用范圍廣：凡能制備相應(yīng)抗體的生物活性物質(zhì)，只要含量不低于RIA探測極限，都可建立

操作簡便：所需試劑少，測量及數(shù)據(jù)處理易于實現(xiàn)自動化主要缺點：

靈敏度很難超過10-15g水平體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)ThankYou!體外放射分析技術(shù)非競爭性放射免疫分析

(免疫放射分析IRMA)一.基本原理：放射核素標(biāo)記在抗體上，與待測抗原結(jié)合后，用一定手段將多余抗體除去，測定復(fù)合物的放射性，其活度與待測抗原呈正相關(guān)

Ag+

*AbAg.*Ab+

*Ab(過量）(B)(F)體外放射分析技術(shù)IRMA與RIA的主要區(qū)別：

RIAIRMA

1.競爭性結(jié)合分析非競爭性結(jié)合分析2.三種主要反應(yīng)試劑兩種主要反應(yīng)試劑3.標(biāo)記抗原標(biāo)記抗體4.復(fù)合物放射活度與復(fù)合物放射活度與待測抗原呈負(fù)相關(guān)待測抗原呈正相關(guān)5.NSB主要影響高劑NSB主要影響低劑量反應(yīng)量反應(yīng)體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)IRMA主要優(yōu)點：

溫育時間短：37℃溫育2

3小時即可靈敏度高：是RIA的10

100倍

測量范圍寬：標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍寬,RIA為2個數(shù)量級，IRMA可達3個數(shù)量級特異性強：應(yīng)用針對某一抗原決定簇的單抗,不易發(fā)生交叉反應(yīng)IRMA主要缺點：

需要二種McAb

抗體用量大體外放射分析技術(shù)非放射標(biāo)記的免疫分析法

化學(xué)發(fā)光分析時間分辨熒光分析酶免疫分析體外放射分析技術(shù)體外放射分析技術(shù)電化學(xué)發(fā)光（ECL）：

ECL是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫之后的新一代標(biāo)記免疫測定技術(shù)

ECL是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的化學(xué)反應(yīng)，實際上包括了電、化學(xué)發(fā)光兩個過程，故是化學(xué)發(fā)光的一種發(fā)展，電化學(xué)反應(yīng)在電極表面周而復(fù)始的進行，光信號明顯增強，因而ECL與CL的差異在于：ECL是電啟動發(fā)光反應(yīng)，CL是通過化合物簡單的混合啟動的發(fā)光反應(yīng)。ECL反應(yīng)更易精確控制，更具靈活性。ECL反應(yīng)原理：化學(xué)發(fā)光反應(yīng)導(dǎo)致光的發(fā)射是來自釕（Ru）化合物的電的激發(fā)，而不是化學(xué)的激發(fā)。體外放射分析技術(shù)二.時間分辨熒光免疫

（time-resolvedfluorescenceimmunossay

—TRFIA）稀土族中的鑭系元素（Eu、Tb、Sm、Dy等）以離子價態(tài)時，受到紫外光或激光等激發(fā)后，會以熒光的形式發(fā)射光譜，其激發(fā)光光譜的波長和發(fā)射熒光的強度因離子不同而有差異，而且具有相當(dāng)長的衰減時間，這樣就為時間分辨熒光(TRF)所發(fā)射的信號采集和多標(biāo)記的應(yīng)用提供了條件。TRFIA是一種以鑭系元素螯合物標(biāo)記抗體或抗原，利用時間分辨熒光光度計測量法排除檢品中非特異性熒光干擾的測量技術(shù)。銪：（Eu—europium）鋱：（Tb—terbium）釤：（Sm—samarium）鏑：（Dy—dysprosium）體外放射分析技術(shù)原理：

TRFIA的標(biāo)記物由鑭系元素螯合物與Ab或Ag組成。待測物通過免疫反應(yīng)形成的復(fù)合物上，標(biāo)有鑭系元素（Eu3+），經(jīng)紫外線激發(fā)后會發(fā)出熒光。但連接在復(fù)合物上的Eu發(fā)射的熒光很弱，需要將其游離出來再形成一個能發(fā)射強熒光的絡(luò)合物。因此在免疫反應(yīng)結(jié)束后，需向體系中加入一種“熒光增強劑”，大大增加信號，所以該技術(shù)有時也稱為解離增強鑭系熒光免疫分析（DELFIA）。所謂時間分辨是指Eu3+受激活后產(chǎn)生壽命較長的熒光，而一般干擾熒光壽命較短，固可用儀器把測量時間定在每次激發(fā)后的數(shù)百

s之后才開始，干擾熒光已衰減到很低水平，所取熒光信號是熒光衰減過程的中間一段。螯合劑：異硫氰酸苯基-EDTA