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實(shí)驗(yàn)二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:間接法
---測(cè)乙型肝炎病毒表面抗體(HBsAb)Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA1ppt課件完整酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù),可用于檢測(cè)體液中微量的特異性抗體或抗原。首先,抗原、抗體的特異性反應(yīng)在一種固相載體表面-聚苯乙烯微量反應(yīng)板孔中進(jìn)行,通過(guò)洗滌去除多余的游離反應(yīng)物;然后加入酶標(biāo)記的抗體或酶標(biāo)記的抗抗體,從而形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物(雙抗體夾心法)或抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物(間接法);此時(shí)加入酶底物和顯色劑,在酶催化底物后,液體呈現(xiàn)顯色反應(yīng)。液體顯色的強(qiáng)弱與復(fù)合物中待測(cè)抗原或抗體的量呈正比,借此可檢測(cè)待測(cè)抗原或抗體的有無(wú)及含量。該技術(shù)的特點(diǎn)是敏感性高,特異性強(qiáng),操作簡(jiǎn)易,結(jié)果容易觀察。實(shí)驗(yàn)原理:2ppt課件完整免疫酶技術(shù)是利用酶標(biāo)記抗體或抗原,以檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。其原理是酶與抗體或抗原結(jié)合后既不改變抗體或抗原的特異性及免疫反應(yīng)性,也不影響酶的催化效能。當(dāng)存在相應(yīng)酶底物時(shí),酶能催化產(chǎn)生有顏色的產(chǎn)物,顏色的有無(wú)及深淺能反映相應(yīng)的抗原或抗體是否存在及其量的多少。實(shí)驗(yàn)原理:3ppt課件完整ELISA的測(cè)定方法包括:雙抗體夾心法:檢測(cè)抗原最常用的方法間接法:檢測(cè)抗體最常用的方法競(jìng)爭(zhēng)法:既可檢測(cè)抗原,亦可檢測(cè)抗體生物素-親和素系統(tǒng)ELISA法:是在ELISA中引入生物素或親和素放大系統(tǒng),檢測(cè)極微量的抗原或抗體的方法。4ppt課件完整直接法間接法5ppt課件完整6ppt課件完整BAS-ELISA底物1.已知Ab包被固相2.加待檢標(biāo)本3.加生物素標(biāo)記的特異性抗體4.加酶標(biāo)記的親和素5.加底物顯色親和素酶生物素待檢標(biāo)本biotin-avidin-system,生物素-親和素系統(tǒng)此法敏感性更高。用于抗原抗體以及DNA、RNA的檢測(cè)。7ppt課件完整材料和試劑:1.HBsAg、包被液。2.待檢人血清。3.酶標(biāo)記的抗HBsAb抗體。4.HBsAb陽(yáng)性對(duì)照血清、HBsAb陰性對(duì)照血清5.洗滌液:PH7.4
0.01mol/LPBS-吐溫20。6.底物溶液:OPD-H2O2或TMD-H2O2。7.終止液:2mol/LH2SO4。8.酶標(biāo)反應(yīng)板、移液器、恒溫箱、酶標(biāo)儀
酶標(biāo)板移液器酶標(biāo)儀8ppt課件完整操作步驟:包被:將HBsAg用包被液作適當(dāng)稀釋(1:100),在96孔反應(yīng)板中每孔加100μl,置37℃2h后再移置4℃過(guò)夜。洗滌:將96孔反應(yīng)板傾去包被液,用洗滌液PBS-吐溫20加滿各孔,置3min,傾去,如此反復(fù)3次。(前兩步已完成)
9ppt課件完整1.已知抗原包被酶標(biāo)板2.1棄去板內(nèi)包被抗原2.2拍干2.3加滿洗滌液(重復(fù)三次)10ppt課件完整3.加樣(1)陽(yáng)性對(duì)照:第1、2孔加HBsAb陽(yáng)性對(duì)照血清50μl;(2)陰性對(duì)照:第3、4孔加HBsAb陰性對(duì)照血清50μl;(3)空白對(duì)照:第5孔加生理鹽水100μl;(4)余下各孔加待檢血清50μl。11ppt課件完整加酶標(biāo)記的抗HBsAb抗體:除空白對(duì)照外各孔50μl,充分混勻。將即時(shí)帖覆蓋于反應(yīng)板上,37℃孵育30min。棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體,拍干,用洗滌液注滿各孔、靜置30秒、再拍干,重復(fù)洗滌5次。(操作同2)顯色:各孔(包括空白對(duì)照)加底物A液50μl(1滴),底物B液50μl(1滴),置37℃避光溫育15min。終止反應(yīng):各孔加終止液50μl(2mol/LH2SO4)。比色:將反應(yīng)板以酶標(biāo)儀450nm處用空白孔調(diào)零,測(cè)各孔OD值。
12ppt課件完整6.顯色各孔(包括空白對(duì)照)加底物A液50μl(1滴),底物B液50μl(1滴),置37℃避光溫育15min7.終止反應(yīng)各孔加終止液50μl(2mol/LH2SO4)13ppt課件完整OPD(鄰苯二胺)經(jīng)酶作用后的顯色反應(yīng)終止前終止后TMB四甲基聯(lián)苯胺經(jīng)酶作用后的顯色反應(yīng)終止前終止后14ppt課件完整結(jié)果判斷:計(jì)算:判斷值=陰性對(duì)照平均OD值×2.1結(jié)果判斷:待測(cè)樣品孔OD值大于或等于判斷值為陽(yáng)性;
小于判斷值為陰性。注:陰性對(duì)照OD值小于0.05按0.05計(jì)算,大于0.05按實(shí)際OD值計(jì)算判斷值。
15ppt課件完整注意事項(xiàng):試劑及待測(cè)標(biāo)本使用前應(yīng)平衡至室溫,并將試劑混勻,棄去1~2滴垂直滴加;嚴(yán)格按照操作程序依次加樣,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性;應(yīng)盡量避免孔中有氣泡,以免所測(cè)得OD值不準(zhǔn)確。
16ppt課件完整思考題:1.免疫標(biāo)記技術(shù)有哪些?各有何特點(diǎn)?。2.ELISA操作過(guò)程中應(yīng)注意哪些問(wèn)題?17ppt課件完整THANKS18ppt課件完整2009級(jí)醫(yī)療??茝?fù)習(xí)題一、名詞解釋2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原決定基(表位)、異嗜性抗原、白細(xì)胞分化抗原、TD-Ag、TI-Ag、抗體、免疫球蛋白、單(多)克隆抗體、補(bǔ)體、經(jīng)典途徑、旁路途徑、細(xì)胞因子、IL、IFN、CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式識(shí)別受體(PRR)、抗原提呈細(xì)胞(
APC)、適應(yīng)性免疫應(yīng)答、免疫耐受、免疫調(diào)節(jié)、超敏反應(yīng)、人工主動(dòng)免疫、人工被動(dòng)免疫、計(jì)劃免疫注:紅色標(biāo)記為要求掌握英文19ppt課件完整二、填空題(0.5×40=20分)三、單項(xiàng)選擇題(1×30=30分)20ppt課件完整免疫的三大功能及其生理和病理表現(xiàn)。影響抗原免疫原性的因素。醫(yī)學(xué)上有哪些重要的抗原。簡(jiǎn)述Ig的基本結(jié)構(gòu)。免疫球蛋白有哪些主要的生物學(xué)功能?簡(jiǎn)述補(bǔ)體的組成。補(bǔ)體活化三條途徑的比較。補(bǔ)體有哪些主要生物學(xué)功能?細(xì)胞因子有哪些共同的特性?細(xì)胞因子的主要生物學(xué)作用。簡(jiǎn)答5×2=1021ppt課件完整簡(jiǎn)述MHC分子的結(jié)構(gòu)及其分布。HLA的主要生物學(xué)功能。T細(xì)胞表面有哪些與其功能相關(guān)的重要分子。B細(xì)胞表面有哪些與其功能相關(guān)的重要分子。巨噬細(xì)胞的主要生物學(xué)功能。簡(jiǎn)述免疫應(yīng)答的基本過(guò)程。抗原的提呈途徑(兩條)。固有免疫的組成及其與適應(yīng)性免疫的關(guān)系。兩種人工免疫的主要區(qū)別。預(yù)防接種的注意事項(xiàng)。滅活疫苗與減毒活疫苗的主要區(qū)別。22ppt課件完整論述題(10×2=20)免疫應(yīng)答:如TD抗原誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的過(guò)程;
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