女性生育力保存

女性生育力保存概述原理技術(shù)要點(diǎn)123-01–概述什么是生育力保存概念生育力保存（fertilitypreservation）是指保存卵子或生殖組織的方法和手段，適用于有不孕不育風(fēng)險(xiǎn)的人群和治療某些疾病可能會(huì)影響生育功能的患者為什么做生育力保存根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，全球自然人口增長率在逐年下降，并且照這個(gè)趨勢，我國在2031年后的增長率將成為負(fù)增長人口增長率下降癌癥與死亡率生育功能下降生殖疾病惡性腫瘤其他系統(tǒng)疾病生育年齡推遲社會(huì)發(fā)展生育觀念環(huán)境變化生育質(zhì)量下降生育力低下生育力低下歷史和預(yù)測人口-02–原理冷凍是來自自然的啟示，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)某一種類的青蛙可以在冬季經(jīng)歷零下數(shù)十度冷凍，而在春季解凍且機(jī)體沒有任何損傷研究認(rèn)識(shí)到，這種青蛙冷凍時(shí)體內(nèi)存在丙三醇，代替水為細(xì)胞內(nèi)溶劑，而在春天蘇醒后體內(nèi)丙三醇消失冷凍如何實(shí)現(xiàn)生育力保存低溫下細(xì)胞長期保持“休眠“，在一定條件下細(xì)胞復(fù)蘇精子冷凍技術(shù)發(fā)展1954年1983年1986年1991年1994年1996年胚胎冷凍卵母細(xì)胞冷凍未成熟卵母細(xì)胞體外成熟“三凍”試管嬰兒卵巢組織冷凍精子/睪丸組織保存包括精子保存，睪丸和附睪組織的保存。（常規(guī)冷凍、單精子和稀少精子冷凍’）卵子/胚胎保存慢速/快速玻璃化冷凍卵子（成熟，未成熟）、卵裂期胚胎（D2/D3/D4）、囊胚期（3期、4期、5期、6期）。卵巢組織保存是青春期前女性和癌癥治療無法被延遲的保護(hù)女性唯一生育力的方法其他方法如放射治療前的卵巢移位，生殖干細(xì)胞移植等來源分類狹義的生育力保存生育力保存技術(shù)國內(nèi)首例精子冷凍誕生嬰兒1983湖南醫(yī)科大學(xué)胚胎冷凍誕生嬰兒北京大學(xué)第三醫(yī)院卵母細(xì)胞冷凍誕生嬰兒北京大學(xué)第一醫(yī)院“三凍”試管嬰兒北京大學(xué)第三醫(yī)院單精子冷凍誕生嬰兒上海交通大學(xué)卵巢組織冷凍誕生嬰兒上海長征醫(yī)院（輔助生殖）國內(nèi)首例生育力保存技術(shù)-03–技術(shù)要點(diǎn)231降溫復(fù)溫速率冷凍“冷凍三要素”冷凍保護(hù)劑細(xì)胞

所有能夠預(yù)防或減輕冷凍復(fù)蘇過程中胚胎內(nèi)細(xì)胞冷凍損傷的化學(xué)成分。

通過脫水、調(diào)整滲透壓、減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成并促進(jìn)玻璃化、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞外電解質(zhì)的作用來保護(hù)細(xì)胞在冷凍復(fù)蘇過程中免遭損傷。冷凍保護(hù)劑01概念02原理滲透性保護(hù)劑可滲入細(xì)胞，取代細(xì)胞內(nèi)的水，提高溶液的黏性，弱化水的結(jié)晶過程:二甲基亞楓（DMSO）、乙酰胺(AA)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)、丙三醇等非滲透性保護(hù)劑能溶于水，但不進(jìn)入細(xì)胞，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，促進(jìn)細(xì)胞脫水和防止解凍時(shí)細(xì)胞過度膨脹:蔗糖、聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、聚蔗糖、白蛋白等其他冷凍保護(hù)劑（大分子物質(zhì)）維持膠體滲透壓；降低胚胎透明帶損傷的機(jī)會(huì)；提高冷凍液的黏滯系數(shù)：白蛋白、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐、羥乙基淀粉冷凍保護(hù)劑冰晶形成冷休克溶質(zhì)效應(yīng)重結(jié)晶滲透性休克冷凍損傷機(jī)制12345冷凍損傷機(jī)制P.Mazur,etal.Cryobiology,2005(51):

29-53.P.Mazur,etal.Cryobiology,2007(55):

158-166.低溫顯微鏡與高速攝影儀的完美組合（小鼠）冷凍損傷機(jī)制“冰晶效應(yīng)”：低溫顯微鏡與高速攝影儀的完美組合（小鼠）冷凍損傷機(jī)制“冰晶效應(yīng)”：首次利用利用高速攝像儀捕捉到了細(xì)胞內(nèi)冰晶生長的瞬間玻璃化冷凍（Vitrification）抵抗冷凍損傷方法”：指液體在低溫時(shí)形成“玻璃樣”狀態(tài)，而沒有形成冰核和結(jié)晶Mazur,P.,etal.,ExpCellRes,

1972玻璃化冷凍“雙因素假說”關(guān)鍵極快速降溫目的玻璃化冷凍對細(xì)胞產(chǎn)?較少的冷凍損傷1983首例凍胚獲得妊娠；1985首例冷凍囊胚獲得活產(chǎn)；目前，胚胎冷凍已經(jīng)成為IVF實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)，也從原來的慢速冷凍轉(zhuǎn)為玻璃化冷凍技術(shù)。癌癥患者的胚胎冷凍2006年起開始報(bào)道。而對于癌癥患者和正常人群比較，沒有發(fā)現(xiàn)獲卵數(shù)、受精率、活產(chǎn)數(shù)和出生缺陷的差異。但癌癥患者高質(zhì)量胚胎數(shù)減少，胚胎冷凍需要男方精子，而且，由于抗癌治療的時(shí)限性，很多患者沒有時(shí)間進(jìn)行激素刺激過程。需要注意的是，經(jīng)過一次或者兩次化療過程的患者不建議推薦IVF治療。一是胚胎數(shù)目太少，二事而且可能會(huì)增加先天畸形。一、胚胎冷凍01將胚胎在室溫下置入ES（平衡液）12～15min。此過程我們可以看到細(xì)胞體積先縮小然后又重新擴(kuò)大的變化再將胚胎在室溫下置入VS（冷凍液）中60～90s，時(shí)間必須很短，因?yàn)楦邼舛炔ＡЩ簩?xì)胞有毒。將胚胎移到冷凍載體上。最后將冷凍載體投入LN2（液氮）中冷凍02玻璃化冷凍（胚胎）方法第1例用凍存的成熟卵母細(xì)胞獲得活胎是在1986年。21世紀(jì)初，應(yīng)用玻璃化冷凍技術(shù)把卵母細(xì)胞解凍后進(jìn)行IVF，可以使活產(chǎn)率上升至40%，而胎兒畸形的發(fā)生率未見增加。腫瘤患者成熟卵母細(xì)胞凍存的相關(guān)文獻(xiàn)較少，一項(xiàng)關(guān)于176例腫瘤患者的研究顯示，用玻璃化凍存的成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVF，胚胎移植的活產(chǎn)率與非腫瘤患者結(jié)果相似。凍存的成熟卵母細(xì)胞為促排卵后獲取的卵母細(xì)胞，避免了胚胎冷凍的倫理和道德問題，但臨床妊娠率相對于胚胎冷凍技術(shù)為低。目前尚未批準(zhǔn)未婚女性冷凍保存卵子。二、成熟卵母細(xì)胞冷凍01劃線法浸潤法02玻璃化冷凍（成熟卵子）方法①：2min②：2min③：5min④：60~90S①②④③(A–E)

玻璃化冷凍:MII

冷凍前;收縮

(剛進(jìn)入ES液)

;重新擴(kuò)張（在ES液中2~5分鐘）;完全擴(kuò)張（在ES液中5分鐘后）;裝?載桿前(在VS液中).(F–I)

玻璃化復(fù)蘇:

卵?復(fù)蘇TS(1

M

蔗糖）;(G–H)

復(fù)蘇DS(0.5

M

蔗糖);(I)

復(fù)蘇后在液滴中洗.玻璃化凍融（成熟卵子）未成熟卵母細(xì)胞凍存，主要針對卵巢有激素刺激禁忌證和不能推遲治療的癌癥患者，治療方案應(yīng)在腫瘤治療開始前提出。在化療或放療前10~14d取出未成熟卵母細(xì)胞冷凍，在體外模擬體內(nèi)成熟的微環(huán)境，進(jìn)行卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)（invitromaturation，IVM），成為成熟卵母細(xì)胞。1994年澳大利亞生殖專家為多囊卵巢綜合征患者行IVM和受精，獲得1例活產(chǎn)。IVM可以用于腫瘤患者，不耽誤腫瘤相關(guān)治療，沒有腫瘤播散的風(fēng)險(xiǎn)，是腫瘤患者保護(hù)生育力的有效途徑。三、未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)（IVM）隨著冷凍技術(shù)的發(fā)展，20世紀(jì)末有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)卵巢組織凍存解凍后可以恢復(fù)正常卵泡形態(tài)。此后，卵巢組織凍存移植技術(shù)開始應(yīng)用于臨床。自2004年首例至2018年6月，全球經(jīng)此技術(shù)誕生的健康嬰兒已超過140例，并繼續(xù)呈指數(shù)級(jí)上升。卵巢組織凍存適用于腫瘤、非腫瘤性疾病患者的生育力與卵巢內(nèi)分泌功能的保護(hù)，最佳適應(yīng)證是青春期前、放化療無法延遲以及患有激素敏感性腫瘤的患者。卵巢組織冷凍要在放化療前至少3d內(nèi)進(jìn)行，主要是在癌癥治療前移取富含卵母細(xì)胞的卵巢皮質(zhì)進(jìn)行凍存，在治療結(jié)束后再移植回體內(nèi)。這是目前保存和恢復(fù)青春期前女性生育力的唯一方法多采用腹腔鏡進(jìn)行卵巢組織取材，多數(shù)移植在卵巢外側(cè)壁腹膜。四、卵巢組織冷凍與移植卵巢組織活卵泡計(jì)數(shù)，每個(gè)亮點(diǎn)就是一個(gè)活的卵泡2004年，女性生殖力保護(hù)領(lǐng)域的里程碑：全球報(bào)道第一例卵巢組織凍存、再移植后活產(chǎn)的病例（Donneza