血管性血友病的研究進(jìn)展

血管性血友病的研究進(jìn)展

通常，血液可以在血液循環(huán)中呈液態(tài)，這是因?yàn)樯眢w上存在相互排斥的凝血和抗凝血系統(tǒng)。由于物理、化學(xué)、創(chuàng)傷、感染、免疫和代謝等因素造成凝血和抗凝血系統(tǒng)的功能紊亂,可導(dǎo)致血栓形成。血栓形成涉及心血管內(nèi)皮、血流狀態(tài)和凝血反應(yīng)3方面的改變。首先,血管內(nèi)皮受損是血栓形成最重要的因素,內(nèi)皮細(xì)胞損傷后,內(nèi)皮下膠原纖維暴露,與血小板膜相互作用使得血小板活化。各種不同的黏附蛋白分子如血管性血友病因子(vWF)和纖黏蛋白(FN)可富集在損傷區(qū)域。其中vWF主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成,是血小板在基質(zhì)或血管基底膜的主要黏附蛋白。vWF可與血小板膜糖蛋白GpIb/Ⅸ復(fù)合物結(jié)合,也可與活化血小板膜上的整和素αⅡbβ3結(jié)合。它也含有與膠原和內(nèi)膜下基質(zhì)內(nèi)糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)域,因此它通過架橋作用,促進(jìn)血小板黏附,啟動(dòng)凝血過程,導(dǎo)致血栓形成。其次,血流緩慢或有渦流時(shí),血小板進(jìn)入邊流,黏附于內(nèi)膜的可能性大為增加,同時(shí)凝血因子也容易在局部堆積和活化而啟動(dòng)凝血過程。渦流產(chǎn)生的離心力和血流緩慢,都會(huì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞,使其產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞合成前列腺環(huán)素(PGI2)和組織型血漿素原活化因子(tPA)等物質(zhì)減少,從而抗血小板凝集、抗凝血和降解纖維蛋白的能力降低,也是導(dǎo)致血栓形成的原因。另外,血液的高凝狀態(tài)如DIC、手術(shù)、創(chuàng)傷、妊娠等引起的血液凝固性增高是血栓形成的又一原因。這3種條件往往合并存在,但常以某一條件為主。由于血栓性疾病的巨大危害性,對(duì)于血栓形成機(jī)制、血栓的診斷和抗血栓藥的研究便顯得尤為重要,因此建立簡(jiǎn)單、快速、價(jià)格低廉而實(shí)用的動(dòng)物血栓模型對(duì)于血栓性疾病的研究是十分必要的。本文對(duì)近年來較為常用的一些血栓動(dòng)物模型加以介紹。1物理損傷法1.1血管內(nèi)榨削法原理:刮匙搔刮損傷血管內(nèi)膜,使內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)裸露,促使血小板與ECM(主要是膠原纖維)接觸而被激活和黏附。同時(shí)裸露的膠原纖維激活Ⅻ因子以及損傷的內(nèi)皮細(xì)胞釋放出組織因子,啟動(dòng)了內(nèi)源性和外源性凝血過程,導(dǎo)致血栓形成。步驟:麻醉家兔后,分離其股深動(dòng)脈,選擇直徑為1mm的股深動(dòng)脈血管段,用微型血管夾夾住上下兩端,使其中間留有1.5cm長(zhǎng)的血管段為手術(shù)部位。在實(shí)體鏡下,用7號(hào)針頭從血管段上端沿血管向下刺入血管段內(nèi)并順勢(shì)注入生理鹽水沖凈血管內(nèi)的血液,后抽出針頭,再用6號(hào)微型刮匙沿刺破孔送入血管內(nèi),反復(fù)搔刮血管內(nèi)膜。搔刮深度以0.5~0.7cm為宜。搔刮面積盡可能大些,以刮出少量血管內(nèi)膜為宜。稍等片刻,輕輕松動(dòng)血管段遠(yuǎn)端血管夾,使血液充盈血管。待刺孔不滲血時(shí),取下血管段兩端血管夾(不能自行止血時(shí)可用0號(hào)無損傷線縫合刺破孔一針)。觸摸家兔膝內(nèi)側(cè)皮下支動(dòng)脈搏動(dòng)示血管已通暢。然后逐層縫合,關(guān)閉皮膚切口。評(píng)價(jià):此法依據(jù)血栓形成基本原理,在動(dòng)物體內(nèi)形成血栓,方法簡(jiǎn)便、易行,成功率100%,術(shù)后24h即開始有血栓形成,也可用于制備靜脈血栓模型。主要適用于:1)動(dòng)態(tài)觀察血栓形成過程中血栓形態(tài)及血栓變化規(guī)律的研究。2)評(píng)價(jià)藥物溶栓作用的實(shí)驗(yàn)研究。3)與形成和溶解血栓有關(guān)的其他實(shí)驗(yàn)研究。1.2股動(dòng)脈血栓形成術(shù)組原理:股動(dòng)脈內(nèi)放置螺旋鋼絲線圈,造成動(dòng)脈內(nèi)膜損傷,局部血流動(dòng)力學(xué)改變,激活凝血系統(tǒng),促血小板凝集、釋放一系列活性物質(zhì),致血栓形成。步驟:麻醉雄犬后,分離其股動(dòng)脈約7cm,從股動(dòng)脈遠(yuǎn)心端向近心端方向安插自制單股螺旋鋼絲(直徑0.5cm,長(zhǎng)度1.5cm),進(jìn)入血管內(nèi)腔后,行血管縫合術(shù),再用醫(yī)用生物黏合膠黏合。去動(dòng)脈夾,確定血管再通充盈和手術(shù)視野無滲血,逐層縫合,術(shù)畢。評(píng)價(jià):此法可靠易行,重復(fù)性好,血栓由血小板、白細(xì)胞及纖維蛋白構(gòu)成。目前多用于血栓放射免疫顯像方面的研究。1.3ma直流電刺激動(dòng)脈壁形成的血栓原理:1.5mA直流電刺激頸動(dòng)脈壁可使血管損傷,血管內(nèi)膜變得粗糙不平,引起血小板黏附聚集及釋放一系列活性物質(zhì),激活內(nèi)源性凝血系統(tǒng),同時(shí)受損內(nèi)膜釋放的組織凝血活素可激活外源性凝血系統(tǒng),于是動(dòng)脈管腔內(nèi)逐漸形成肉眼可見的混合血栓。步驟:麻醉大鼠后,頸部正中切口,剝離其右側(cè)頸總動(dòng)脈約15mm長(zhǎng),用小塊塑料布遮蓋傷口附近的組織,防止組織溫度影響血管壁表面溫度及刺激電極與周圍組織接觸。刺激電極由2根直徑為1.3mm,間距1.7mm的不銹鋼棒組成,把刺激電極和溫度探子鉤于動(dòng)脈內(nèi)膜上。電流用1.5mA,刺激時(shí)間為7min。當(dāng)血栓阻斷血流后,遠(yuǎn)心端動(dòng)脈溫度驟降,記錄從電刺激開始到溫度驟降所需時(shí)間,稱堵塞時(shí)間(occlusiontime,OT),即為血栓形成時(shí)間。評(píng)價(jià):一般認(rèn)為,動(dòng)脈血栓產(chǎn)生的決定因素是內(nèi)皮損傷及高切率血流(如狹窄),在高切率區(qū)血栓成分以血小板為主,而低切率區(qū)以纖維蛋白和紅細(xì)胞為主。靜脈血栓產(chǎn)生的決定因素是內(nèi)皮損傷,血液淤積呈高凝狀態(tài),血栓主要成分是纖維蛋白、紅細(xì)胞和少量的血小板及白細(xì)胞。此實(shí)驗(yàn)中形成的血栓成分在電刺激區(qū)以血小板及纖維蛋白為主,有少量紅細(xì)胞及白細(xì)胞,而在電刺激遠(yuǎn)端以纖維蛋白及紅細(xì)胞為主,所以1.5mA直流電刺激動(dòng)脈壁形成的血栓在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與人類動(dòng)脈血栓相似,有較好的可比性,適用于抗血栓形成藥物的篩選,抑制血栓形成的藥物能延長(zhǎng)OT值。此模型操作簡(jiǎn)單,但受動(dòng)物年齡、環(huán)境溫度等的影響較大,標(biāo)準(zhǔn)差較大,因而應(yīng)用時(shí)有一定局限性。1.4血栓形成評(píng)定原理:粗絲線結(jié)扎下腔靜脈,引起局部血流淤滯、缺氧,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,啟動(dòng)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)。此外,黏聚的血小板與局部形成的凝血因子也因血流受阻停留在局部,致使血栓形成。步驟:麻醉大鼠后,開腹,分離其下腔靜脈,于左腎靜脈下方用粗絲線結(jié)扎下腔靜脈,縫合腹壁,結(jié)扎2~6h重新打開腹腔,在結(jié)扎線下方2cm處夾閉血管,剖開管腔,取出血栓,60℃烘干后稱量血栓質(zhì)量,以血栓質(zhì)量或血栓形成百分率為指標(biāo)。評(píng)價(jià):一般在結(jié)扎后2h血栓形成率約為60%~80%,此時(shí)處死動(dòng)物主要觀察血栓形成百分率。6h后血栓形成率為100%,此時(shí)應(yīng)觀察血栓質(zhì)量。此方法多用于判定溶栓藥物的體內(nèi)抗血栓作用。2化學(xué)損傷法2.1動(dòng)脈血栓形成的檢測(cè)方法原理:胰蛋白酶具有蛋白水解作用,使血管內(nèi)膜和部分肌層脫落,血小板黏附、聚集,致血栓形成。步驟:麻醉家兔后,暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈約2.5cm,用顯微外科動(dòng)脈夾夾住近心端和遠(yuǎn)心端,兩端分別插入8號(hào)針頭,于針頭進(jìn)入部位結(jié)扎血管,兩結(jié)扎線相距1.5cm,經(jīng)近心端針頭用輸液泵勻速(0.6mL/min)灌注1.0%胰蛋白酶15min。隨后以相同速度灌注生理鹽水沖洗,灌注液經(jīng)遠(yuǎn)心端排出,拔出針頭并用無創(chuàng)傷性針線縫合針孔,打開動(dòng)脈夾使血流復(fù)通。評(píng)價(jià):所形成的血栓富含血小板和纖維蛋白,類似于臨床上動(dòng)脈血栓的形成。方法可靠,重復(fù)性好。用于抗血栓藥物的篩選和研究。2.2刺入動(dòng)脈段內(nèi)殘留血原理:過氧化氫損傷血管內(nèi)膜,引起血小板黏附聚集,致血栓形成。步驟:家兔局麻后,分離其一側(cè)頸總動(dòng)脈,以2個(gè)動(dòng)脈夾夾閉此動(dòng)脈,夾間距離約2.5cm,用4號(hào)針頭刺入動(dòng)脈并固定,迅速抽出動(dòng)脈段內(nèi)殘留血液,并以生理鹽水反復(fù)沖洗3~4次至動(dòng)脈段內(nèi)無殘血。然后以10%H2O2溶液0.4mL分4~5次注入動(dòng)脈段內(nèi)連續(xù)作用10min,再以生理鹽水沖洗2~3次后,用黏合膠黏合針孔,放開血流。評(píng)價(jià):所形成的血栓以白色血栓為主,符合動(dòng)脈血栓的特征,可以用來探索防止血栓形成的方法。2.3血清學(xué)檢測(cè)大鼠內(nèi)皮細(xì)胞損傷原理:角叉菜膠是從海藻中提取的含硫酸多糖物質(zhì),是一種較強(qiáng)的致炎物質(zhì),其誘發(fā)的尾動(dòng)脈局部血栓與血管內(nèi)炎癥密切相關(guān),炎癥時(shí)釋放的大量炎癥介質(zhì),如白介素-1、腫瘤壞死因子等可破壞正常內(nèi)皮細(xì)胞維持凝血與纖溶之間的平衡作用,從而促發(fā)血栓形成;此外,內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)舒血管物質(zhì)如乙酰膽堿等分泌減少,縮血管物質(zhì)如內(nèi)皮素等增多,使局部血管痙攣,加重局部血管缺血缺氧狀況,進(jìn)一步促進(jìn)血栓形成及血管內(nèi)皮損傷。步驟:昆明種雄性小鼠或SD雄性大鼠,角叉菜膠用生理鹽水配制成0.1%和1%,皮下注射。小鼠注射部位在腰背部,大鼠為后肢足跖部。注射3~14h后,多數(shù)動(dòng)物尾尖部出現(xiàn)暗紅色血栓形成區(qū),并逐漸向尾根部擴(kuò)大。48~72h后局部從發(fā)紺變?yōu)楹谏?隨后尾部干細(xì)斷落。評(píng)價(jià):24h實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尾部小靜脈和毛細(xì)血管內(nèi)含有大量纖維素和少量白細(xì)胞及血小板,血管內(nèi)皮細(xì)胞核濃縮呈骰子狀,血管內(nèi)壁中性粒細(xì)胞靠邊。72h可見較大血管呈炎癥改變,伴有混合性血栓形成。由于血栓發(fā)生在尾部,界限明顯,可從體表觀察血栓形成出現(xiàn)的時(shí)間與發(fā)展過程,測(cè)量其波及的范圍或長(zhǎng)度,可為研究體內(nèi)血栓形成全過程提供一個(gè)簡(jiǎn)便、直觀的動(dòng)物模型。2.4動(dòng)脈血栓模型原理:鐵離子侵入血管壁造成血管內(nèi)膜損傷,血小板黏附聚集,血栓形成。步驟:大鼠麻醉后側(cè)臥固定,自眼眥和外耳道中線處剪一切口,暴露及除去顴弓,再暴露顳前窩及鱗狀骨大部分,然后在顴弓和鱗狀骨前聯(lián)合的前下方約2mm處鉆孔,開一約2mm直徑的小顱窗,暴露大腦中動(dòng)脈,置一小片塑料薄膜保護(hù)血管周圍組織。將吸有50%三氯化鐵(FeCl3)溶液10μL的小片濾紙敷在該段大腦中動(dòng)脈上20min,共敷2次后去掉濾紙。再用生理鹽水沖洗局部組織,逐層縫合。評(píng)價(jià):方法簡(jiǎn)單、可靠,重復(fù)性好,形成的動(dòng)脈血栓成分為血小板、紅細(xì)胞及纖維蛋白等,為混合血栓。而且此方法仍保留有大腦中動(dòng)脈,可進(jìn)行血管觀察,較接近于臨床,且此模型既能反映抗栓藥又能反映溶栓藥的藥效,用已知的抗栓藥物阿司匹林和溶栓藥物尿激酶均驗(yàn)證了這一點(diǎn)。該模型還可以利用TTC染色技術(shù)直觀地觀察腦梗死程度。其不足之處是動(dòng)物的顴弓被去除,影響動(dòng)物進(jìn)食,不利于作長(zhǎng)期觀察等,此法還有待改進(jìn)。2.5動(dòng)脈血栓模型原理:利用虎紅B(四碘四氯熒光素鈉)在單色綠光下產(chǎn)生并釋放單態(tài)氧,使血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),不僅使細(xì)胞膜的通透性改變,Ca2+內(nèi)流增加,而且脂質(zhì)過氧化物增加可破壞前列環(huán)素(PGI2)與血栓素B2(TXB2)的平衡,促進(jìn)血小板聚集與黏附,激活凝血過程,形成血栓并進(jìn)一步阻塞血管導(dǎo)致缺血;同時(shí)凝血過程中產(chǎn)生大量血管活性物質(zhì)及神經(jīng)毒性物質(zhì),破壞腦細(xì)胞尤其是血-腦脊液屏障,與人類腦梗死發(fā)生極為相似。步驟:麻醉大鼠后,經(jīng)左側(cè)顳部入路,于左眼外眥和左耳外耳道連線上近眼外眥1/3處作一垂直的長(zhǎng)約2cm的弧形切口,分離顳肌,去除顴弓,用拉鉤拉開下頜關(guān)節(jié),在卵圓孔前上方用牙科鉆作一直徑為5mm的骨窗,切開硬腦膜即可見大腦中動(dòng)脈(MCA),選擇MCA的近端(起始部)和從嗅束至大腦下靜脈間的一段MCA為光照部位,自制LG-150B冷光源的光纖端口距離MCA表面血管約5mm,將光纖所射出的光束垂直對(duì)準(zhǔn)MCA,光照分2步,首先將光纖移至MCA起始部,經(jīng)股靜脈注入1.5%虎紅B(2mL/kg)5min后,持續(xù)光照10min,然后將光纖移到嗅束至大腦下靜脈段MCA血管表面,再注入半量虎紅B,仍持續(xù)照射10min,至此血栓模型制作完畢。評(píng)價(jià):此模型成功率100%,模型穩(wěn)定、可靠,造模時(shí)采用分離顳肌、拉開下頜關(guān)節(jié),保留術(shù)后鼠的咀嚼功能,提高動(dòng)物存活率。采用分步照射法,在2次注射光敏劑時(shí)劑量減半,既可避免動(dòng)物損傷程度過重,又可制備出較實(shí)用、可靠的大腦中動(dòng)脈血栓模型。由于該模型的形成過程與人類腦血栓形成發(fā)病機(jī)制、血栓形成過程、損害程度較為相近,加之光照或光敏劑對(duì)血