基于尼羅紅熒光探針的小球藻中油脂的測(cè)定

基于尼羅紅熒光探針的小球藻中油脂的測(cè)定

由于巖石燃料開采量的限制和碳氧化碳對(duì)世界氣候變化的影響，產(chǎn)生的生物源引起了廣泛的關(guān)注。其中，微藻具有快速生長、占用低土、高油含量等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)（三聚甘油可占30.70%）。尼羅紅(9-diethylamino-5-benzo[α]phenoxazinone)是一種脂溶性的熒光染料,能夠與活體細(xì)胞內(nèi)的中性脂或其他脂類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),而被用于微生物、細(xì)菌、酵母、浮游植物等細(xì)胞中脂類的定性和定量分析本文選擇從天然水體篩選出的產(chǎn)油綠藻—小球藻作為研究對(duì)象,采用酶標(biāo)儀作為檢測(cè)儀器,研究了激發(fā)光波長、尼羅紅濃度、二甲基亞砜(DMSO)濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度對(duì)微藻油脂測(cè)定的影響,分析了微藻油脂含量與尼紅羅相對(duì)熒光測(cè)定值之間的線性關(guān)系,為小球藻油脂含量的測(cè)定提供了一個(gè)簡便、快速的方法.1材料和方法1.1超純金屬試劑尼羅紅(NileRed,NR)購自美國MPBiomedicals公司.DMSO、丙酮購自美國Pharmco-Aaper公司.試劑采用Milli-Q制備的超純水(18MΩ·cm)進(jìn)行配制.48孔酶標(biāo)板(Costar354848)購自美國Costar公司.其他化學(xué)藥劑均為分析純?cè)噭?1.2多功能酶標(biāo)儀測(cè)定美國BioTekSynergyHT多功能酶標(biāo)儀;SlMAmincoue5f83000UV/Vis紫外可見分光光度計(jì);LabnetOrbit1.3海藻培養(yǎng)小球藻Chlorellavulgaris來自美國紐約州立大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室所分離的藻種.培養(yǎng)基組成為(mg·L1.4酶標(biāo)法測(cè)定酶首先向酶標(biāo)板中加入800μL藻液,然后加入190μLDMSO(二甲基亞砜),于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩混合30s后,加入10μL50μg·mL酶標(biāo)儀的測(cè)定條件為:激發(fā)光波長485nm,帶寬20nm,發(fā)射光波長580nm,帶寬50nm;激發(fā)光入射方向?yàn)槊笜?biāo)板上方,發(fā)射光檢測(cè)方向?yàn)槊笜?biāo)板上方,溫度40℃,以800μL超純水代替藻液的樣品作為NR的自發(fā)熒光背景值,作為參比樣品,設(shè)置為1000FU.1.5其他分析和測(cè)量取約2.5mL藻液置于比色皿中,于波長680nm處測(cè)定吸光度值,所測(cè)值為藻液光密度OD2結(jié)果與討論2.1激發(fā)光波長對(duì)系統(tǒng)反應(yīng)的影響培養(yǎng)20d后的藻液光密度值OD尼羅紅作為脂類熒光探針,與細(xì)胞中中性油脂反應(yīng)后,在激發(fā)光波長450—500nm,發(fā)射光波長大于528nm時(shí),在熒光顯微鏡下可觀測(cè)到金黃色熒光,而極性脂與尼羅紅反應(yīng)后,在激發(fā)光波長515—560nm,發(fā)射光波長大于590nm時(shí),觀測(cè)到的是紅色熒光2.2dmso濃度和反應(yīng)時(shí)間的影響DMSO作為一種促滲劑,能夠促進(jìn)細(xì)胞壁對(duì)尼羅紅的滲透,從而提高尼羅紅與細(xì)胞內(nèi)油脂的反應(yīng)效率.當(dāng)NR與藻液的反應(yīng)時(shí)間為5min時(shí),DMSO濃度對(duì)熒光值測(cè)定的影響如圖2所示.結(jié)果顯示,濃度為0—30%時(shí),其產(chǎn)生的背景熒光值相差不大,在858—1349之間.但DMSO濃度對(duì)藻樣熒光的測(cè)定影響較大,當(dāng)DMSO終濃度為20%時(shí),藻液加入NR后的熒光值最大,達(dá)到6061,當(dāng)DMSO濃度再增大時(shí),熒光值反而下降,這是由于過高的DMSO濃度會(huì)對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性,從而影響了熒光值的測(cè)定.當(dāng)DMSO濃度為0時(shí),其熒光值也較高,與25%DMSO的結(jié)果相近,顯示不加入DMSO也可以得到較好的測(cè)定結(jié)果,這與Chen等人的結(jié)果并不一致圖2還顯示,10%DMSO反應(yīng)5min后的熒光值是所有結(jié)果中最低的,甚至低于不加入DMSO的熒光值.但是圖3顯示,隨著時(shí)間的延長,10%DMSO的熒光值在20min后出現(xiàn)了明顯的上升,80min后超過了25%、30%DMSO以及不加DMSO時(shí)的熒光值,這是由于DMSO濃度較低時(shí),DMSO滲透較慢,導(dǎo)致熒光值隨時(shí)間而逐步上升.至于起始一段時(shí)間內(nèi)熒光值較低的現(xiàn)象與其他結(jié)果并不一致2.3測(cè)定溫度的確定反應(yīng)溫度對(duì)熒光值的測(cè)定影響可見圖4.結(jié)果顯示,當(dāng)NR與藻液的反應(yīng)溫度為40℃時(shí),所測(cè)得的藻液熒光值最高,當(dāng)溫度升高到45℃時(shí),所測(cè)定的熒光值反而有所下降,表明高溫對(duì)藻細(xì)胞的活性帶來影響,而影響了熒光值的測(cè)定.其他的研究結(jié)果顯示,有的最佳測(cè)定溫度是在35—40℃2.4最終濃度為nr的影響NR終濃度對(duì)熒光值的影響見圖5.結(jié)果顯示,當(dāng)NR濃度為0.50μg·mL2.5藻細(xì)胞油脂的熒光值隨時(shí)間的變化結(jié)果為了快速測(cè)定微藻產(chǎn)生的油脂含量,通?？梢詫⒉捎弥亓糠y(cè)定的油脂含量與尼羅紅熒光值之間建立一定的線性關(guān)系,通過測(cè)定尼羅紅熒光值而推算出藻細(xì)胞油脂的產(chǎn)量尼羅紅熒光強(qiáng)度與時(shí)間存在很大的關(guān)系,從圖6的結(jié)果可以看出,在加入NR后,藻液的熒光值稍有所提高后,出現(xiàn)了下降的趨勢(shì).但是50—60min后,高濃度藻液的NR熒光值卻又出現(xiàn)了明顯的上升.在Elsey等人的研究中3小球藻油脂含量的測(cè)定(1)采用NR作為熒光探針,可以測(cè)定小球藻所產(chǎn)生的中性油脂含量,測(cè)定條件為:激發(fā)光波長485nm,發(fā)