酶法分析生科院

酶法分析生科院第1頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月酶法分析與酶活力測定的異同

相同點：二者均使用了酶促反應不同點：

測定的目的物不同，實驗設計不同

酶活力測定中待測物為酶，因而酶必須是限速因素，而底物和輔酶等必須過量；酶法分析中待測物不是酶，而是底物或輔酶或抑制劑或激動劑等等。因而必須使待測物成為該反應的限速因素。因此二者是不相同的，不能混為一談。第2頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月第3頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月終點法(總變量法)

終點法是以下述原理為基礎的：

先借助酶反應（單個酶反應或者幾種酶構(gòu)成的偶聯(lián)酶反應）使被測物質(zhì)定量地進行轉(zhuǎn)變，然后在轉(zhuǎn)變完成后，測定底物、產(chǎn)物或輔酶物質(zhì)（第二底物）等的變化量，因此稱為終點測定法。終點法是酶法分析中最普遍，最廣泛的定量法。第4頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月終點法的條件必須有專一地作用該被測物質(zhì)的酶，并能得到它的制品。能夠確定使這種酶反應接近進行完全的條件。反應中底物的減少或產(chǎn)物的增加或輔酶物質(zhì)的改變等可以借助某種簡單的方法進行測定。在能滿足這些條件的情況下，最好是采用單一酶反應就能進行定量檢測。第5頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月使用終點法應注意的問題1．酶的底物專一性：絕對專一性相對專一性立體異構(gòu)專一性

對于酶法分析來說，最理想的酶是具有絕對專一性的酶。第6頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月2．反應的平衡對于終點法來說，要求反應接近進行完全，故對不同的酶反應須采取不同的措施使反應進行到接近完全。若酶反應平衡十分偏向進行方向，則可方便的用終點法進行檢測，不需進行任何處理。若反應的平衡并不十分偏向進行方向，或偏向逆方向，那么由于反應不能完全，因而也就不能正常定量。為了解決這一問題，通常采取以下一些措施：對于雙底物反應盡可能提高第二底物的濃度對氧化還原之類與H＋有關(guān)的反應要選擇適當?shù)膒H設法除去產(chǎn)物用具有不同平衡常數(shù)的輔酶類似物代替原有的輔酶和第二底物的再生系統(tǒng)偶聯(lián)，則第一底物可能完全轉(zhuǎn)化為反應產(chǎn)物第7頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月3．反應液中的酶量

對于一個具體的測定來說不同的酶反應有不同的Km值，通過米氏方程和均相溶液反應的動力學推算和分析，可以大致得到如下的結(jié)論：對于單酶反應的酶法分析：所加入的酶量（u/ml）相當于Km（mmol）對于偶聯(lián)反應的酶法分析，所加入的酶量如下：第一反應為酶量（u/ml）相當于Km1（mmol）第二反應為酶量（u/ml）相當于（1～2）×Km2（mmol）

第8頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月4.反應產(chǎn)物抑制第9頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月終點法的種類（一）單酶反應定量法：

在這種單酶反應中，不需指示反應，可以直接測定S的減少量或P的增加量和輔酶的變化量。1、底物減少量的測定可定量的物質(zhì)有：胞嘧啶（280nm）、腺嘌呤（280nm）和尿酸（293nm或297nm）。第10頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月尿酸的定量第11頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月2.產(chǎn)物增加量的測定

此法可定量的物質(zhì)有：（1）各種氨基酸和草酸（2）黃嘌呤、次黃嘌呤以及CoA3.輔酶變化量的測定

條件：測定以NAD或NADP為輔酶的脫氫酶的底物的量，此法適用范圍很廣。

原理：NADH和NADPH在340nm有特征最大吸收峰，而NAD和NADP在340nm卻無這一吸收帶，故可應用于NAD或NADP為輔酶的脫氫酶反應，通過測定340nm吸光度的變化，就可以對作用相應脫氫酶底物的物質(zhì)進行定量分析。第12頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月羥基丙酮酸定量可用兩種酶：甘油酸脫氫酶（專一性強）

乳酸脫氫酶（丙酮酸干擾）第14頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）和指示酶反應偶聯(lián)的定量法常用在下面兩種情況第16頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月指示酶反應1.以脫氫酶為指示劑第17頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月A2-A1代表了G-1-P的量第18頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月[例2]

樣品中同時含有G和果糖，利用酶法分析測定G的量（利用己糖激酶）第19頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月[例3]在一個比色杯中同時定量丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸和D-2-磷酸甘油酸第21頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月第22頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月2.以脫氫酶以外的酶作為指示劑過氧化物酶作為指示劑第23頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月心肌黃酶作為指示劑492nm有強吸收例：L-谷氨酸的定量測定測定反應：L-Glu+NAD+H2O

谷氨酸脫氫酶+α-酮戊二酸+NADH+H+指示反應：NADH+INT+H心肌黃酶NAD+甲臜

++NADH+H+INT(碘代硝基四唑)NAD+甲臜

心肌黃酶+第24頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月酶循環(huán)放大分析法第25頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月酶循環(huán)放大法的原理、步驟（超微量前列腺素的定量為例）（三步）第一步：轉(zhuǎn)換反應第二步：循環(huán)反應第26頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月第三步：指示反應：利用終點法測Glu（或3磷酸甘油酸）的量如何測得循環(huán)數(shù)n？用已知量的NADH已知作為NADH轉(zhuǎn)在相同條件下進行循環(huán)反應和指示反應NADH已知=NADH指示/nn=NADH指示/NADH已知（即用已知量的NADH已知平行做循環(huán)反應，指示反應）第27頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月在這種方法中應注意的幾個問題：1.在進行循環(huán)反應之前，必須設法除去轉(zhuǎn)換反應中剩余的輔酶，在上例中就是設法除去NAD+除去的方式：NAD和NADP的氧化型和還原型在不同的pH值下其穩(wěn)定性不同，可通過調(diào)節(jié)pH來達到目的

NAD+NADP+(氧化型)NADHNADPH(還原型)pH2（25℃）1h穩(wěn)定5min99.9%被破壞pH13（60℃）

10min99.9%被破壞1001h仍穩(wěn)定

2.在循環(huán)反應中，底物（不是輔酶）需夠量3.要用已知量的循環(huán)底物（上例中NADH）平行做循環(huán)反應和指示反應以求得循環(huán)數(shù)n第28頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月單酶循環(huán)第30頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月第31頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）應用范圍1.有循環(huán)底物參加的酶反應的底物或酶可測定NAD、NADP、CoA等2.能與以上反應偶聯(lián)的酶反應的底物或酶可測定第32頁，課件共35頁，創(chuàng)作于2023年2月“酶法分析”一章的要求1掌握終點法的測定原理，終點法的條件2使用終點法測定時應注意的問題3掌握通過測定輔酶變化量的單酶反應定量法（學會如何進行實驗設計和分析）4