結(jié)構(gòu)生物學(xué)介紹和進(jìn)展專業(yè)知識(shí)講座

結(jié)構(gòu)生物學(xué)的定義顧名思義，結(jié)構(gòu)生物學(xué)就是研究各種生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸、糖類等）的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及如何在生物體內(nèi)發(fā)揮作用的學(xué)科。結(jié)構(gòu)的重要性生物大分子的功能主要取決于其結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)的異常會(huì)引起功能的改變，也是所謂“構(gòu)像病”的原因。瘋牛病等構(gòu)像病的罪魁禍?zhǔn)住狿rion正常的Prion致病的Prion由于結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致了瘋牛病、克雅氏?。–reutzfeldt-JacobDisease；CJD）等傳染性腦海綿狀病變（TSE）。分子生物學(xué)：

現(xiàn)代生物學(xué)的主流方向分子生物學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)中最重要的學(xué)科，幾乎每年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)都授予這方面的研究。研究各種生物大分子的功能以及在生物體中的生物化學(xué)過程，是分子生物學(xué)最重要的任務(wù)。結(jié)構(gòu)在現(xiàn)代生物學(xué)里的中心地位在分子生物學(xué)中，結(jié)構(gòu)是非常重要的內(nèi)容。只有在獲得相應(yīng)分子的結(jié)構(gòu)后才能深入地研究其功能和生化過程。舉例酶蛋白：只有在了解了酶的活性中心的結(jié)構(gòu)以及如何與底物的結(jié)合后，才能真正了解這種酶的作用機(jī)理；對(duì)肌肉中的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的結(jié)構(gòu)有了詳細(xì)的了解，才能說明肌肉收縮和非肌肉細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的機(jī)理。NobelinStructure一共有11項(xiàng)諾貝爾獎(jiǎng)授予生物分子結(jié)構(gòu)方面的研究。有結(jié)構(gòu)解析方法研究，也有重要的生物分子結(jié)構(gòu)和功能研究的工作。TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962FrancisHarryComptonCrickJamesDeweyWatsonMauriceHughFrederickWilkins"fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry1962MaxFerdinandPerutzJohnCowderyKendrew"fortheirstudiesofthestructuresofglobularproteins"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry1964DorothyCrowfootHodgkin"forherdeterminationsbyX-raytechniquesofthestructuresofimportantbiochemicalsubstances"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry1982AaronKlug"forhisdevelopmentofcrystallographicelectronmicroscopyandhisstructuralelucidationofbiologicallyimportantnucleicacid-proteincomplexes"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry1985HerbertA.HauptmanJeromeKarle"fortheiroutstandingachievementsinthedevelopmentofdirectmethodsforthedeterminationofcrystalstructures"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry1988"forthedeterminationofthethree-dimensionalstructureofaphotosyntheticreactioncentre"JohannDeisenhoferRobertHuberHartmutMichelFrom/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry1997PaulD.BoyerJohnE.WalkerJensC.Skou"fortheirelucidationoftheenzymaticmechanismunderlyingthesynthesisofadenosinetriphosphate(ATP)""forthefirstdiscoveryofanion-transportingenzyme,Na+,K+-ATPase"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry2002JohnB.FennKoichiTanakaKurtWüthrich"forthedevelopmentofmethodsforidentificationandstructureanalysesofbiologicalmacromolecules""fortheirdevelopmentofsoftdesorptionionisationmethodsformassspectrometricanalysesofbiologicalmacromolecules""forhisdevelopmentofnuclearmagneticresonancespectroscopyfordeterminingthethree-dimensionalstructureofbiologicalmacromoleculesinsolution"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry2003PeterAgreRoderickMacKinnon"fordiscoveriesconcerningchannelsincellmembranes""forthediscoveryofwaterchannels""forstructuralandmechanisticstudiesofionchannels"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry2006"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription"From/nobel_prizes/TheNobelPrizeinChemistry2009"forstudiesofthestructureandfunctionoftheribosome"VenkatramanRamakrishnanThomasA.SteitzAdaE.YonathFrom/nobel_prizes/內(nèi)螺旋外螺旋選擇篩鉀離子通道的三維結(jié)構(gòu)圖2003年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)鉀離子透過細(xì)胞膜的輸運(yùn)行為，對(duì)體內(nèi)或是大腦中神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)至關(guān)重要。然而離子通道的選擇性透過行為卻困擾了生物學(xué)家許多年。鉀離子通道的離子導(dǎo)通機(jī)理通過鉀離子通道的三維結(jié)構(gòu)，解釋了它對(duì)離子的選擇性透過機(jī)理。（1）“多離子透過”的過程：原先通道里有三個(gè)鉀離子被束縛在里面，只有體積合適的鉀離子才能通過撞擊，將另一個(gè)鉀離子從相反方向彈出，而體積較小的納離子不行。（2）通道內(nèi)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)，模擬了鉀離子在溶液中的水合狀態(tài)。只有水合的鉀離子能夠在通道內(nèi)猶如在水溶液內(nèi)一樣自由地運(yùn)動(dòng)。鉀離子通道RodMacKinnon,RockefellerUniversityPotassiumion(centerredball)intheK+Channelat3.2?resolution.PreferentialflowofK+ionsconstitutestheelectricalcurrentinnervecells.Science

280,69-77(1998)Cell

95,649-655(1998)Science

289,123-127(2000)Nature

414,37-42(2001)Nature

414,43-48(2001)Nature

415,287-294(2002)Cell111,967-965(2002)Nature423,33–41(2003)結(jié)構(gòu)生物學(xué)進(jìn)展：

Roadtostructureswithoutcrystals董宇輝BSRF，IHEP，CASOutline同步輻射（SynchrotronRadiation）小角散射（SmallAngleX-rayScattering）自由電子激光（FreeElectronLaser）同步輻射

SynchrotronRadiationLettherebelight:andtherewaslight.--GenesisX射線晶體學(xué)和NMR是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定的主要技術(shù)/pdb/statistics/holdings.do，2012年10月2日99.2%測(cè)定方法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)X射線晶體學(xué)74768NMR9616EM綜合方法45851Other165總數(shù)85058各種生物基因組和功能基因組數(shù)據(jù)基因克隆蛋白制備結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)構(gòu)測(cè)定樣品制備蛋白結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定的流程靶標(biāo)克隆表達(dá)可溶純化結(jié)構(gòu)152721486664081474843802008.6.16/cgi-bin/report.pl獲得生物大分子結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)核磁共振方法：分辨率與靈敏度不夠，不能確定分子量很大的結(jié)構(gòu)，要求樣品濃度極高，測(cè)定效率低下（幾個(gè)星期甚至幾個(gè)月的數(shù)據(jù)收集時(shí)間）。晶體學(xué)方法：對(duì)樣品要求過高，高質(zhì)量晶體的獲得困難。實(shí)驗(yàn)耗時(shí)單晶難以獲得相位解析需要特殊單晶分辨率低靈敏度低Howtoobtainstructuresbyproteincrystallography?Expression/purificationcrystallizationX-raydiffractionphasingModelbuildingRefinedstructure蛋白質(zhì)晶體衍射能力很弱：大部分原子為C、N、O、S；晶體質(zhì)量差，晶胞大；相位問題解決困難。理想的光源必須具有以下特點(diǎn)：高亮度：衍射能力很弱也可以得到好的數(shù)據(jù)；準(zhǔn)直性好：質(zhì)量差、晶胞大的晶體也可以進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)；能量可調(diào)：多波長(zhǎng)反常散射解決相位問題。同步輻射正好提供了適合的光源。什么是同步輻射？接近光速運(yùn)動(dòng)的電子或正電子在改變運(yùn)動(dòng)方向時(shí)放出的電磁輻射，因?yàn)槭窃谕郊铀倨魃习l(fā)現(xiàn)的，所以稱為同步輻射。這種輻射強(qiáng)度高、覆蓋的頻譜范圍廣，可以任意選擇所需要的波長(zhǎng)且連續(xù)可調(diào)，因此成為一種科學(xué)研究的新光源。同步輻射裝置示意圖Booster儲(chǔ)存環(huán)部分圖片來自SSRL三種發(fā)光元件彎轉(zhuǎn)磁鐵扭擺器(Wiggler)波蕩器(undulator)圖片來自SSRL發(fā)光元件光束線實(shí)驗(yàn)站同步輻射的亮度（單位時(shí)間，單位面積，單位立體角，一定光子能量范圍內(nèi)的光子數(shù)）和轉(zhuǎn)靶X光機(jī)的比較。圖片來自MAXIV設(shè)計(jì)報(bào)告Divergence2p立體角：180°1毫弧度：0.06°三代光源甚至達(dá)到10微弧度實(shí)際的蛋白質(zhì)單晶真實(shí)單晶體內(nèi)部不是完美的，可以看成有一系列的小晶體鑲嵌而成，每個(gè)小晶體可以認(rèn)為是完美的晶體。這些小晶體取向無序的程度以“鑲嵌度”表征。分子置換法（Molecular

Replacement，MR）同晶置換法（Isomorphous

Replacement，IR，SIR/MIR）反常散射法（Anomalous

Dispersion，AD，SAD/MAD）直接法（Direct

method）Phasing

methodsEnergyrange同步輻射覆蓋了一個(gè)很寬的頻譜范圍，從遠(yuǎn)紅外到硬X光。而X光機(jī)只能提供幾個(gè)分立的光子能量。MIR（多對(duì)同晶置換）設(shè)法在蛋白質(zhì)晶體中加入一些重金屬離子，同時(shí)晶體結(jié)構(gòu)不發(fā)生大的變化（同晶置換），置換前后結(jié)構(gòu)因子的關(guān)系。一個(gè)同晶置換可以得到兩個(gè)可能的解。兩個(gè)同晶置換就可以得到唯一的解?！巴捷椛?硒代+樣品冷凍”已經(jīng)成為解析全新結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)方法。多波長(zhǎng)反常衍射（MAD）MIR可以解析全新結(jié)構(gòu)，如果能夠得到足夠的同晶置換晶體的話。如果蛋白質(zhì)里有金屬離子存在，就可以使用MAD方法。硒代。原子散射因子MAD選擇吸收邊附近的幾個(gè)波長(zhǎng)，相當(dāng)于幾個(gè)不同的完全同晶的置換。分子生物學(xué)提供了硒代的手段，對(duì)于解析全新結(jié)構(gòu)非常有利。關(guān)鍵是衍射實(shí)驗(yàn)使用的X射線（能量）波長(zhǎng)必須可變！同步輻射的作用同步輻射的加入，大大提高了結(jié)構(gòu)測(cè)定的速度。PDB(ProteinDataBank)圖片來自http:///蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的增加同步輻射促進(jìn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析1980-1990年，獲得解析的蛋白質(zhì)數(shù)量大幅度增加；1980左右，同步輻射開始應(yīng)用到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中，1990年各種技術(shù)趨于成熟，同步輻射大規(guī)模應(yīng)用于生物大分子結(jié)構(gòu)解析。生物學(xué)家的評(píng)論生物大分子結(jié)構(gòu)測(cè)定影響了生物學(xué)幾乎所有的領(lǐng)域。幾乎每個(gè)星期都有激動(dòng)人心的結(jié)構(gòu)發(fā)表在如Science和Nature這樣的雜志上。生物大分子晶體學(xué)已經(jīng)比其他任何學(xué)科更多地得益于同步輻射的應(yīng)用。

------StevenE.Ealick，CornellUniv.MAD實(shí)驗(yàn)的波長(zhǎng)選擇f1f2f3f4四個(gè)可選擇的波長(zhǎng)f1：peak，f"最大；f2：inflection，f'最大；f3：highenergyremote；f4：lowenergyremote。流行做法：一邊收集數(shù)據(jù)，一邊解析結(jié)構(gòu)。一般完成f1數(shù)據(jù)的收集，進(jìn)行f2數(shù)據(jù)收集時(shí)就完成相位解析了。幾個(gè)波長(zhǎng)？理論上2個(gè)波長(zhǎng)就足夠破解雙解了，但是有直接法的幫助，1個(gè)波長(zhǎng)也就足夠了。當(dāng)然波長(zhǎng)越多會(huì)越好，但是實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)往往會(huì)帶來不可預(yù)知的因素：輻射損傷，儀器設(shè)備的不穩(wěn)定等。反常衍射的分類單波長(zhǎng)反常衍射：SAD；多波長(zhǎng)反常衍射：MAD。Peak波長(zhǎng)得到的相角三個(gè)波長(zhǎng)得到的相角烯醇酶-磷酸酶E1

人源“Coactosin-like”蛋白peak與h-remote的組合三個(gè)波長(zhǎng)同步輻射蛋白質(zhì)晶體學(xué)的發(fā)展更小的晶體：生長(zhǎng)晶體是蛋白質(zhì)晶體學(xué)的瓶頸，如果能夠解析小晶體的結(jié)構(gòu)將使得許多困難的結(jié)構(gòu)成為可能。更自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)流程：無論是解析結(jié)構(gòu)還是在藥物研究中的應(yīng)用，大量的嘗試需要自動(dòng)化的流程。目前，10微米左右的質(zhì)量良好的晶體已經(jīng)能夠解析出生物大分子結(jié)構(gòu)。（ESRF，發(fā)表于J.Mol.Biol.,367,310-318.2007）SSRF：可能達(dá)到5微米。但是有相當(dāng)多的生物大分子只能夠獲得1微米左右的微晶，如左圖所示的與老年性癡呆相關(guān)的蛋白質(zhì)很難形成大的單晶。目前同步輻射裝置希望能提供1微米的聚焦光斑解析這些m大小晶體的結(jié)構(gòu)。將大大降低生物大分子結(jié)晶的門檻，極大地推動(dòng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和藥物研發(fā)的進(jìn)展。1m量級(jí)蛋白質(zhì)晶體的結(jié)構(gòu)解析Summary同步輻射提供了解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最適合的光源。同步輻射的廣泛應(yīng)用，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及蛋白質(zhì)晶體學(xué)理論、軟件的完善，使得解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成為相對(duì)比較常規(guī)的技術(shù)。小角散射

SmallAngleX-rayScatteringSimplestisthebest.獲得生物大分子結(jié)構(gòu)的困難核磁共振方法：分辨率與靈敏度不夠，不能確定分子量很大的結(jié)構(gòu)，要求樣品濃度極高，測(cè)定效率低下（幾個(gè)星期甚至幾個(gè)月的數(shù)據(jù)收集時(shí)間）。晶體學(xué)方法：對(duì)樣品要求過高，晶體不是想得到就能得到的。實(shí)驗(yàn)耗時(shí)單晶難以獲得相位解析需要特殊單晶分辨率低靈敏度低NMR技術(shù)可以研究溶液狀態(tài)的蛋白，但是受到很多限制測(cè)定一系列二維、三維核磁共振譜，通過譜峰位置計(jì)算原子之間的鍵長(zhǎng)、鍵角、二面角等立體化學(xué)參數(shù)，從而得到整個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)。存在的限制：靈敏度不夠：需要很濃的溶液分辨率不高：存在分子量上限（<39kD）采集速度慢：樣品穩(wěn)定性問題缺少弱相互作用和中間體捕獲技術(shù)膜蛋白結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法不完善蛋白質(zhì)晶體學(xué)的問題主要在于樣品得到晶體探測(cè)衍射點(diǎn)強(qiáng)度確定衍射相位得到電子密度分布進(jìn)而獲得原子位置主要問題：?jiǎn)尉щy于制備，特別是復(fù)合物解析相位需要特殊晶體小角散射（SAXS）不需要晶體，在溶液中就可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。不受分子量限制。不受濃度限制。實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，對(duì)樣品穩(wěn)定性要求低。儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，可以開展原位實(shí)驗(yàn)。圖片來自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa小角散射所需的樣品~50微升溶液；蛋白濃度在0.1-10mg/ml；分子量在幾千至幾億Da；單分散（mono-disperse）。圖片來自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa小角散射的優(yōu)點(diǎn)對(duì)樣品的要求很低：溶液樣品既可，分子量、濃度不拘，穩(wěn)定性不用很高。有些時(shí)候結(jié)晶會(huì)引起一些結(jié)構(gòu)上的變化（由于結(jié)晶時(shí)候的packingforce導(dǎo)致），小角散射實(shí)驗(yàn)在溶液中進(jìn)行，更好地反映生物大分子的真實(shí)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)相對(duì)簡(jiǎn)單快速，提供了原位研究動(dòng)態(tài)過程的可能性。小角散射（1D）vs衍射（3D）1條譜線 上萬個(gè)衍射點(diǎn)結(jié)構(gòu)信息（3D）圖片來自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa小角散射的缺點(diǎn)小角散射得到的信息量很少，要得到三維的結(jié)構(gòu)信息是很困難的。只能得到一些比較粗略、低分辨的信息，如生物大分子的大小、形狀等。衍射可以獲得非常多的衍射點(diǎn)強(qiáng)度，能夠解析出三維的結(jié)構(gòu)來。相對(duì)于晶體學(xué)衍射，小角散射的理論還不夠成熟。經(jīng)典應(yīng)用生物大分子（散射體）的大小、分布；大致形狀（球形、柱形、橢球形等）。分子越大，實(shí)驗(yàn)越容易：和晶體學(xué)正好相反。最近發(fā)展可以擬合出生物大分子的形狀：Shapedetermination利用一系列球諧函數(shù)表征分子外形，這個(gè)外形（包絡(luò)）之外密度為零，之內(nèi)是均勻的密度。或者用一系列的虛擬原子（dummyatoms）或者虛擬殘基來描述生物大分子，調(diào)整這些虛擬原子或者虛擬殘基的位置來確定分子形狀。M.B.Kozin,V.V.VolkovandD.I.SvergunJ.Appl.Cryst.(1997).30,811–815用球諧函數(shù)展開來表示生物大分子形狀。擬合展開系數(shù)，使得計(jì)算譜線與實(shí)驗(yàn)最接近。需要正則化方法來進(jìn)行擬合。程序：gnomD.I.Svergun，J.Appl.Cryst.(1992).25,495–503用虛擬原子來表示生物大分子形狀。模擬退火這些虛擬原子的位置，使得計(jì)算譜線與實(shí)驗(yàn)最接近。程序：damin和gasborD.I.Svergun，BiophysicalJournal(1999).76,2879–2886重建晶體結(jié)構(gòu)中丟失部分晶體衍射中看不到的部分一般都是一些柔性的loop區(qū)域。利用小角散射可以擬合出這些loop區(qū)域來。程序：credoPetoukhov,Eady,Brown,andSvergun，BiophysicalJournal(2002).

83,

3112–3125生物大分子復(fù)合物已知各亞基分子結(jié)構(gòu)，而復(fù)合物結(jié)構(gòu)未知；改變亞基相對(duì)位置及取向來擬合實(shí)驗(yàn)譜線。程序：masshaKonarev,PetoukhovandSvergun，J.Appl.Cryst.(2001).34,527–532研究實(shí)例（一）

從基因到功能：dCMP脫氨酶Smu206：AnunknownproteinfromS.mutanscatalyzesthedeaminationofdCMPtodeoxyuridine-5’-monophosphate(dUMP);containsaZn2+whichisimportantforthecatalysis;catalyticactivitydependsonthefeedbackregulationbasedontheratioofdCTPtodTTP,whichareboththeendproductsofthepyrimidinesalvagepathway.Fromthegenesequence,smu206fromStreptococcusmutansUA159shouldbedeoxycytidylatedeaminase.oroticacidUMPCMPRNAdUMPdCMPdCDPdCTPdTMPdTDPdTTPDNAdCDisanenzymeinvolvinginpyrimidinesalvagepathway.ItcatalysesthedeaminationofdCMPtodUMP,whichisthesubstrateofthymidylatesynthaseforproducingTMP.dCDreducestheefficiencyofanticancerandantiviraldrugsviadeaminationatthenucleotidelevel,thisindicatesthatdCDinhibitorshavepotentialapplicationsinchemotherapy.+H2OdCMPdeaminasedCMPdUMPdCTPdTTPMg2+activatorinhibitorMg2+ThedeanimationofdCMPtodUMP.dCTPasactivatorwhiledTTPasinhibitor.AMg2+isnecessaryforthefunctionofdCTPordTTP.RegulationofC&TamountsAGTCdCMPExcessiveCmeansinsufficientT,reactionstarts:dCTPactivating;ExcessiveT,reactionsuppresses:dTTPinhibiting.dTTPinhibitingdCTPactivatingKineticassayofSm206:yes,itisSm-dCDTheactivityofdCMP;TheregulationofdCTP/dTTPratio.StructuredeterminationofSm-dCDExpressedinE.coli.Purification,Crystallation.Znfound.StructuresolvedviaZn-MAD.Resolutionof2.8?.Complexofenzyme,substrateanalogPdR(pyrimidine-2-onedeoxyribotide)andactivatordCTPisalsocrtstallized.Structuresolvedto1.65?.ThecrystalsSample:8mg/mlSm-dCDReservoir:0.1MTris-HCl,1.5M(NH4)2SO4,15%(v/v)glycerol.Growthunder20°C,3days.Dehydrationwasusedtoimprovethediffraction.Sample:10mg/mlSm-dCD,1mMPdR,5mMdCTPand5mMMgCl2.Reservoir:0.1MMES,1.6M(NH4)2SO4,12%(v/v)dioxane.Growthunder20°C,5days.StructuredeterminationofSm-dCDThestructureofSm-dCDThesubstrateanalogPdRisfoundasitshydratederivativeDHOMP(3,4-dihydrouridine-5’-monophosphate)ThehexamerofSm-dCDTheallostericregulatordCTPisfoundbetweentwomonomers.TwodifferentZnionsTherolesofZnindCDfunctionOneZnionisimportantforthecatalysis.ItbindstoHis71,Cys99,Cys102andDHOMP.Theseresiduesarehighlyconservedinallspecies.AnotherZniondoesnotcomeindirectcontactwiththesubstrateanalogandtheallostericregulator.Itplaysaroleintheloopstability,whichshapesthesitethatbindsthephosphategroupofthesubstrateanalog.TheresiduesaroundthisZnionarenotconserved.MammaliandCDsdonotcontainthisZnion.ConformationmodificationduetoDHOMPanddCTPbindingApoenzyme:openconformation(blue);Complex:closeconformation(red).ModificationofquaternarystructureAdimerisolatedfromthehexamer.ThebindingofDHOMPanddCTPresultinadenserhexamerandfavorablefortheproteinfunction.Apoenzyme:blue;Complex:red.Catalyticmechanism研究實(shí)例（二）：CooA來源于光合細(xì)菌Rhodospirillumrubrum的CO-oxidationactivatorprotein(CooA)。CooA結(jié)合CO后導(dǎo)致構(gòu)型變化，以結(jié)合特定的DNA。這個(gè)蛋白屬于catabolitegeneactivatorprotein(CAP)家族，與fumarateandnitratereductase(FNR)andthecAMP-receptorprotein(CRP)類似。FromShujiAkiyamaetal.,J.Mol.Biol.(2004)341,651–668.圖片來自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa圖片來自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa圖片來自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawaCooA在結(jié)合CO后的變化并不支持晶體學(xué)研究的結(jié)果。Guinierplotof：CO-freeCO-boundedCO的結(jié)合對(duì)CooA大小改變很小。增強(qiáng)了蛋白之間的相互作用，表面電荷分布改變了。圖片來自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawaSAXS的結(jié)果的仔細(xì)分析否認(rèn)了CooA的linear-bent機(jī)制。Rg以及P(r)的變化遠(yuǎn)比linear-bent機(jī)制導(dǎo)致的小。圖片來自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa導(dǎo)致晶體學(xué)結(jié)構(gòu)出問題的原因：

結(jié)晶時(shí)產(chǎn)生的Packingforce通過晶體學(xué)得到的結(jié)構(gòu)計(jì)算出來的SAXS曲線和實(shí)驗(yàn)明顯不同，說明在結(jié)晶過程中packingforce改變了蛋白的結(jié)構(gòu)。晶體學(xué)結(jié)構(gòu)中兩個(gè)DNA結(jié)合區(qū)域明顯不對(duì)稱（而CO結(jié)合區(qū)域卻是對(duì)稱的），這種結(jié)構(gòu)并不常見。圖片來自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa圖片來自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa研究實(shí)例（三）：GltS來源于Azospirillumbrasilense（巴西固氮螺菌）的glutamatesynthase(谷氨酸合成酶，GltS)。細(xì)菌的NADPH-dependentGltS(NADPH-GltS)包括兩個(gè)亞基：a亞基，162kDa；b亞基，52.3kDa。a亞基結(jié)構(gòu)已知：1ea0。b亞基有個(gè)類似物：residues50–520ofpigliverDPD(1h7w)。（N-terminalregionofporcinedihydropyrimidinedehydrogenase）M.V.Petoukhov,D.I.Svergun,P.V.Konarev,S.Ravasio,R.H.H.vandenHeuvel,B.Curti&M.A.Vanoni(2003).J.Biol.Chem.,278,299332×L-glutamateNADP(+)L-glutamine2-oxoglutarateNADPH+++Fromhttp://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/enzymes/谷氨酸合成酶GltS是一種含有Fe-S中心的黃素蛋白，催化L-谷酰胺的酰胺基還原轉(zhuǎn)移到2-酮戊二酸（2-OG）的C-2位上。根據(jù)不同的酶種類，這個(gè)過程需要NADH或者NADPH，還需要FAD或者FMN，F(xiàn)e-S中心是必須的。細(xì)菌的GltS需要NADPH，真核生物的需要NADP。這個(gè)酶和谷酰胺合成酶（glutaminesynthetase）是微生物和植物中氮素同化（ammoniaassimilation）的主要途徑，在動(dòng)物中的作用還不清楚。細(xì)菌包含的NADPH-dependentGltS（NADPH-GltS）由a、b兩個(gè)部分組成，包含1個(gè)FAD，1個(gè)FMN和3個(gè)不同的Fe-Sclusters。NADPH-GltS的催化機(jī)理示意圖活性的Glts是a和b亞基組成的holoenzyme。小角散射結(jié)果表明a亞基在溶液中是4聚體；b亞基是單體和二聚體混合。兩個(gè)亞基組成的holoenzyme在溶液中是4聚體。SAXS實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1：a亞基；2：Glts；3：b亞基。黑點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；紅線：abinitio模型（外形）；綠色點(diǎn)劃線：a2（曲線1）和a4b（曲線2）晶體學(xué)模型；綠色三角（曲線3）：?jiǎn)误wb；綠色圓（曲線3）：二體b；藍(lán)線：剛體擬合后的a4（曲線1）和(ab)4；藍(lán)色圓（曲線3）：擬合后的b單體與二體混合模型。a4Gltsb2a4重疊在Glts上外形a4Gltsb2a4ab(ab)4最終確定的結(jié)構(gòu)：4聚的a亞基外圍包圍著4個(gè)b亞基。Summary小角散射提供了研究生物大分子溶液狀態(tài)的一種方便手段。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能夠提供的信息量不多，但是在有部分晶體結(jié)構(gòu)的情況下，小角散射能夠發(fā)揮相當(dāng)重要的作用。小角散射研究生物大分子溶液結(jié)構(gòu)仍是一種正在發(fā)展的技術(shù)，有很大的提升余地。自由電子激光

FreeElectronLaser發(fā)展才是硬道理。--鄧小平各種生物基因組和功能基因組數(shù)據(jù)基因克隆蛋白制備結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)構(gòu)測(cè)定樣品制備蛋白結(jié)構(gòu)晶體，晶體，晶體！靶標(biāo)克隆表達(dá)可溶純化結(jié)構(gòu)152721486664081474843802008.6.16/cgi-bin/report.pl解決的方法：分子不排隊(duì)，讓光子排隊(duì)探測(cè)器分子相干光源利用一束相干性很好、強(qiáng)度很高的X光來照射分子，記錄下相干散射的強(qiáng)度，也能得到分子中原子的結(jié)構(gòu)。晶體的衍射：雖然每一個(gè)光子到達(dá)晶體的時(shí)間（位相，phase）是無規(guī)的，但是晶體內(nèi)原子空間排列的有序性限定了出射光子只能沿著有限的方向，因此出射的X射線強(qiáng)度還是很高的，可以很容易就探測(cè)得到。分子的散射：在原子空間排列無序的條件下，出射光子的方向不受限制，因此出射的X射線強(qiáng)度變得非常微弱。入射X射線的光子如果沒有確定的位相關(guān)系（相干），那么即使目前最強(qiáng)的光源，這些無序到達(dá)的光子產(chǎn)生的信號(hào)還是弱得無法探測(cè)。（強(qiáng)度相加，N個(gè)光子N倍信號(hào)）除非入射X射線的光子“排著整齊的隊(duì)伍”，具有確定的位相關(guān)系（相干），散射的光子產(chǎn)生的信號(hào)就有確定的相位關(guān)系，能夠進(jìn)行振幅疊加，N個(gè)光子產(chǎn)生N2倍信號(hào)（類似共振）。關(guān)鍵：光源目前的光源（包括第三代同步輻射）還不能提供足夠的強(qiáng)度和相干性；能夠滿足條件的光源是：X射線自由電子激光（XFEL）。理由：原子分辨率需要X光；強(qiáng)度和相干性需要激光。什么是自由電子激光？讓產(chǎn)生同步輻射的電子同時(shí)發(fā)光（光子相位相同），這樣就得到激光。這個(gè)過程和常規(guī)的激光（可見光、紅外、紫外激光）是類似的。溶菌酶Thesmall30S-subunitoftheThermusThermophilusribosome可能的問題分子損傷：極高的強(qiáng)度會(huì)使分子完全離解，但是XFEL可以在分子離解之前就得到足夠的信號(hào)，計(jì)算機(jī)模擬證實(shí)了這一點(diǎn)。相位問題：過采樣技術(shù)（oversampling）可以解決這個(gè)問題。探測(cè)技術(shù)：需要發(fā)展。實(shí)驗(yàn)技術(shù)：如何獲得單分子的散射信號(hào)，需要研究。XFEL作用下溶菌酶分子的離解2fs的脈沖可以得到可靠的結(jié)構(gòu)，5fs以上會(huì)有誤差，10fs以上基本不可用。實(shí)驗(yàn)技術(shù)的問題強(qiáng)度很高的XFEL，怎么固定樣品？既然能夠把樣品在瞬間揮發(fā)，也會(huì)在瞬間揮發(fā)固定樣品的樣品架！實(shí)驗(yàn)技術(shù)（1）：

Sprayingtechniques實(shí)驗(yàn)技術(shù)（2）：

Samplesembeddedinvitreousice把蛋白質(zhì)固定在非晶態(tài)的冰里面。類似冷凍電鏡技術(shù)。使用一束脈沖足夠短的激光，就可以得到可信的散射信號(hào)。但是散射信號(hào)如何變成