福建農(nóng)林大學(xué)生物工程研究法課程實(shí)驗(yàn)方案模板

福建農(nóng)林大學(xué)生物工程研究法課程實(shí)驗(yàn)方案資料內(nèi)容僅供參考，如有不當(dāng)或者侵權(quán)，請聯(lián)系本人改正或者刪除。福建農(nóng)林大學(xué)生物工程研究法課程實(shí)驗(yàn)方案發(fā)酵工程研究法學(xué)院:生命科學(xué)學(xué)院學(xué)院:生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)年級:07微生物一班組長:李彩斌指導(dǎo)老師:孫淑靜小組成員:馬起鋁,李國凡藍(lán)金蓮葉碧霞鄭梅欽李彩斌發(fā)酵工程課程實(shí)驗(yàn)方案一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握發(fā)酵微生物菌種篩選原理和方法2、學(xué)習(xí)和掌握酒精發(fā)酵方法和發(fā)酵過程的監(jiān)測方法3、掌握酒精對糖和淀粉的轉(zhuǎn)化率的計(jì)算方法二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。培養(yǎng)基中一般含有微生物所必須的碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長素以及水分等。任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)徹底滅菌。發(fā)酵成熟醪的成分隨原料的種類、加工方法、菌種性能不同而不同,分成不揮發(fā)性成分和揮發(fā)性成分兩大類。許多微生物都能利用已糖化進(jìn)行酒精發(fā)酵,但在實(shí)際生產(chǎn)中用于酒精發(fā)酵的幾乎全是酒精酵母,俗稱酵母。利用淀粉質(zhì)原料的酒母在分類上叫啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),是屬于子囊菌亞門酵母屬的一種單細(xì)胞微生物。該種酵母菌繁殖速度快,發(fā)酵能力即產(chǎn)酒精能力強(qiáng),并具有較強(qiáng)的耐酒精能力。淀粉質(zhì)原料酒精生產(chǎn)的工藝流程如圖所示:三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和器材1、原料:玉米粉、已知酶活力糖化酶2、試劑:氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、DNS、碘液、pH4.6的醋酸鹽緩沖液3、器材:三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、血球計(jì)數(shù)器四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)酵母菌種的分離與篩選1、稱量50g的從超市中買來的葡萄放置搗爛,溶于上述的90ml的無菌水中,振蕩30min,制成原液。2、在超凈臺上,取1ml原液于9ml裝有無菌水的試管中,搖勻,制成10-1菌液,按照同樣的方法做成6個(gè)稀釋梯度,難后選擇4個(gè)合適的梯度進(jìn)行涂平板,培養(yǎng)基為孟加拉紅培養(yǎng)基,封口,每個(gè)梯度涂布三個(gè)重復(fù)。3、將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4d。4、觀察菌落的生長情況,選取菌落生長均勻的濃度梯度,進(jìn)行劃線分離純化。5、在37℃培養(yǎng)箱中在培養(yǎng)3d。6、選取分離純化好的單菌落用顯微鏡進(jìn)行觀察。酵母菌落形態(tài)一般大而突起,邊緣可見球狀、卵圓狀或假絲狀細(xì)胞。7、挑取鑒定出來的菌落與PDA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。(二)酵母產(chǎn)酒精1、糊化:將600ml水加到糖化鍋中,按照料水比1:4的比例稱量玉米粉150g,調(diào)節(jié)pH值為5-6,加入氯化鈣(對固形物0.2％),加入液化酶(12-20U/g淀粉),在劇烈攪拌下,先加熱至72℃,保溫15min,再加熱至90℃,并維持30min,以達(dá)到所需的液化程度(DE值:15-18％),碘反應(yīng)呈棕紅色。液化結(jié)束后,再升溫至120℃,保持5-8min,滅酶,壓濾去渣,降溫就能夠進(jìn)行糖化了。2、糖化:液化結(jié)束后,迅速將料液用硫酸將pH調(diào)至4.3-4.5,同時(shí)迅速降溫至60℃。按照0.6-0.8%/g淀粉的比例加入糖化酶,攪拌均勻,放入水浴鍋中,60℃保溫若干小時(shí)后(10h左右),當(dāng)用無水酒精檢驗(yàn)無糊精存在時(shí)。用碘液測定糖化液是否還含有淀粉,若未完全則繼續(xù)糖化直至完全為止。注意開始時(shí)液面位置并隨時(shí)補(bǔ)足蒸發(fā)掉的水分。糖化結(jié)束后,將料液pH調(diào)至4.8-5.0,同時(shí),將料液加熱至加熱90℃,保溫30分鐘．然后將料液溫度降至60-70℃,開始過濾。3、發(fā)酵前還原糖測定:取一些糖化好的糖化液,測定其還原糖的含量(用DNS法測定)。3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取6支試管,按下表1順序加入各種試劑。表1不同濃度葡萄糖的光密度試管編號123456蒸餾水32.52.01.51.00.5500ug/ml葡萄糖00.511.52.02.51各加入DNS試劑2.0mL;2沸水浴加熱5min;3立即用流水冷卻;3定容至25mL;550nm處測定OD值最后以葡萄糖含量(mg/mL)為橫坐標(biāo),光吸收值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.2糖化液還原糖測定(1)取5ml糖化液進(jìn)行過濾,濾液用pH4.6的醋酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋,約稀釋10-100倍。(2)取甲乙兩支10ml的試管,甲試管加入1ml稀釋的糖化液,乙試管加入1mlpH4.6的緩沖液,分別加入2mlpH4.6的醋酸鹽緩沖液和2mlDNS試劑?；靹蚝蠓兴〖訜?min,立即冷卻定容到5ml。(3)混勻分別于550nm處比色,用乙試管調(diào)零,測3次,記錄光密度值。(4)然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的還原糖含量Gmg。(5)根據(jù)以下公式計(jì)算樣品中還原糖的含量:還原糖含量(mg/ml)=Ga(a-稀釋倍數(shù),G-還原糖量(mg))4、發(fā)酵:將糖化好的糖化液分裝于三角瓶中,每瓶接種約15ml已培養(yǎng)24h的酵母菌,塞上膠塞(在加入的時(shí)候一定要注意防止雜菌的侵入,嚴(yán)格使用酒精火保護(hù)罐口,并保持罐內(nèi)正壓)。5、用干布將三角瓶各部分擦干凈,稱量初始發(fā)酵液的重量,將發(fā)酵液放于30℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵,并于以后每天稱量一次,直至重量減至恒重為止。并用DNS法測定發(fā)酵后的還原糖含量。(三)酒精發(fā)酵液各項(xiàng)指標(biāo)測定1、酒精度測定:1)蒸餾:裝好全套蒸餾裝置,取100ml發(fā)酵能力較強(qiáng)的發(fā)酵液,放入500ml的蒸餾瓶中,加入100ml水,迅速安裝到冷凝管上進(jìn)行蒸餾,將容量瓶置于冷凝管下端收集餾出液100ml時(shí),停止蒸餾,搖勻備用。2)將酒精比重計(jì)慢慢放入酒精發(fā)酵液的蒸餾液中,手持溫度計(jì)在比重計(jì)桿旁,待溫度穩(wěn)定后,酒精停穩(wěn)定時(shí)讀數(shù),讀數(shù)時(shí)視線應(yīng)與刻度計(jì)相平。3)校正:根據(jù)所量的酒精度和溫度、查表校正為20度時(shí)的酒精度。2、發(fā)酵液還原糖的測定:方法同發(fā)酵前還原糖測定方法一樣3、酒精發(fā)酵液的微生物檢查(1)酵母形態(tài)的觀察用美藍(lán)染色法取酒精發(fā)酵液菌體進(jìn)行制片,在放大40倍及100倍的顯微鏡下觀察酵母形態(tài),用測微尺測量酵母細(xì)胞的大小,并進(jìn)行死活鑒別。具體步驟如下:首先,在載玻片中央加一滴0.1%美藍(lán)染色液,液滴不可過多或過少,以免蓋上蓋玻片時(shí),溢出或留有氣泡。然后按無菌操作法取在發(fā)酵液上培養(yǎng)了48小時(shí)的篩選出的酵母菌懸液一滴,放在美藍(lán)染色液中,使菌體與染色液均勻混合。取蓋玻片一塊,小心地蓋在液滴上,不能將蓋玻片平放下去,應(yīng)先將蓋玻片的一邊與液滴接觸,然后將蓋玻片慢慢放下,這樣能夠避免產(chǎn)生氣泡。放置3Min。其次,將制好的水浸片先用低倍鏡觀察,半個(gè)小時(shí)后用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況,同時(shí)能夠根據(jù)是否染上顏色來區(qū)別死活細(xì)胞,因?yàn)榛罴?xì)胞的新陳代謝不停地進(jìn)行著,因此細(xì)胞內(nèi)氧化還原值(rH)頗小,而還原力強(qiáng),若有無毒的染料進(jìn)入細(xì)胞,即被還原脫色,但死細(xì)胞及代謝緩慢的老細(xì)胞無此還原力。美藍(lán)無毒,且能為活細(xì)胞還原成無色,故可用以區(qū)別細(xì)胞的死活。但美藍(lán)濃度、作用時(shí)間等均有影響,應(yīng)加注意。酵母細(xì)胞數(shù)的測定(酵母耐酒精能力的測定)1)取樣檢測獲細(xì)胞數(shù)目,用血球計(jì)數(shù)法:用適當(dāng)稀釋的酵母菌液,加到蓋有蓋玻片的血球計(jì)數(shù)板上,根據(jù)所數(shù)計(jì)數(shù)格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)、加入的菌液量和稀釋倍數(shù),計(jì)算出每毫升菌液的含菌量。2)耐酒精能力的測試:配成濃度為02%。。。。。等的水濃液加入等量的擴(kuò)培過的酵母濃液,每隔2小時(shí)用血球計(jì)數(shù)板測酵母數(shù)目(改成血球計(jì)數(shù)板測數(shù)目)(3)不同酵母菌產(chǎn)酒精能力的測定本實(shí)驗(yàn)主要采用稱重法與放出二氧化碳量等測定酵母的發(fā)酵能力:發(fā)酵瓶于30℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng),每天稱重一次,記錄重量,由于每瓶用于發(fā)酵的糖化液體積相同,因此只需計(jì)算出單位時(shí)間內(nèi)CO2釋放量,直至發(fā)酵自然停止。以CO2產(chǎn)生量為縱坐標(biāo),發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)測定CO2產(chǎn)生曲線。(4)不同酵母凝聚性的測定:(采用本斯值法)將酵母菌在30℃搖床中搖瓶培養(yǎng)36h,離心棄掉上清夜,經(jīng)過無菌水洗滌3次后,稱重1g酵母菌于刻度15ml的離心管中,注入10mlpH值為4.5的醋酸鹽緩沖液,20℃水浴中放置20min,搖動離心管5min使酵母細(xì)胞重新均勻懸浮,靜置,記錄10min是酵母細(xì)胞的毫升數(shù),即為本斯值,根據(jù)本斯值判斷5個(gè)酵母菌株的凝聚性強(qiáng)弱。4、酒精生產(chǎn)中糖化型淀粉酶的酶活力測定(碘量法)1)待測酶液的制備取發(fā)酵液的濾液用pH4.6醋酸鈉緩沖液適當(dāng)稀釋,供測定用。2)酶活力的測定于甲、乙兩支管中,分別加入2%可溶性淀粉溶液25m1及0.2mol/LpH4.6的乙酸緩沖液5ml,搖勻,在40℃的恒溫水浴中預(yù)熱5-10min,在甲管中加入待測酶液2ml(酶活總量約100-170單位),乙管中加2ml蒸餾水作對照,搖勻,立即記時(shí)。準(zhǔn)確反應(yīng)1h后,取出各加20%NaOH溶液0.2m1終止酶反應(yīng),冷卻至室溫。取上述反應(yīng)液5m1放入碘量瓶中,準(zhǔn)確加入0.1mol/L碘液10ml,再加入0.1mol/L氫氧化鈉15ml,搖勻后暗處放置15min。加入1mol/L硫酸2m1,用0.05mol/L硫代硫酸鈉滴定至無色為終點(diǎn)。其與空白消耗硫代硫酸鈉毫升數(shù)的差值應(yīng)在4~6之間,否則要適當(dāng)調(diào)整酶液的稀釋倍數(shù)。計(jì)算糖化酶活力單位的定義:在40℃、pH4.6的條件下,1小時(shí)水解可溶性淀粉產(chǎn)生1毫克葡萄糖所需的酶量為一個(gè)糖化酶活力單位。酶活力單位=(A-B)N×90.05×(1/2)×(32.2/5)×n式中A——空白所消耗硫代硫酸鈉體積(ml);B——樣品所消耗硫代硫酸鈉體積(ml);N——硫代硫酸鈉濃度(0.1mol/L);90.05——1mllmol/L硫代硫酸鈉所相當(dāng)?shù)钠咸烟琴|(zhì)(mg);1/2——折算成1m1酶液的量32.2——反應(yīng)液總體積(ml)5——吸取反應(yīng)液樣品的體積(ml);n——酶液稀釋倍數(shù)。5、出酒率、酒精對糖和淀粉的