APE1在肝細胞癌組織芯片的表達及臨床病理意義

APE1在肝細胞癌組織芯片的表達及臨床病理意義

作者：鄭智華,黃愛民,劉景豐,臧盛兵,高凌云,陳水平

【摘要】目的探討脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1(APE1)基因在原發(fā)性肝細胞癌(HCC)的表達及其與臨床病理變化的關系。方法應用免疫組織化學方法,檢測包含HCC及轉移灶、癌旁肝硬化組織、癌旁慢性肝炎組織和正常肝組織的組織芯片中APE1的表達情況,結合臨床病理資料進行統(tǒng)計分析。結果APE1在癌旁肝硬化組織、癌旁慢性肝炎組織和正常肝組織以細胞核表達為主,在HCC和轉移灶組織以細胞質細胞核聯(lián)合表達為主()。細胞質與細胞核染色強度均與HCC分級和轉移密切相關(),細胞質染色強度還與腫瘤包膜有無浸潤有關()。結論APE1蛋白表達與HCC惡性表型有關,APE1蛋白過表達及細胞質表達的出現(xiàn)可能成為HCC預后不良的指標之一。

【關鍵詞】癌,肝細胞;內切核酸酶類;芯片分析技術;免疫組織化學;預后

ABSTRACT:ObjectiveTostudytheassociationofapurinc/apyrimidinicendonuclease1(APE1)expressionwithclinicopathologicparametersinhepatocelluarcarcinoma(HCC).MethodsAPE1proteinwasdetectedinseventissuechips,whichcontainsHCC,para-carcinomatissues,para-carcinomachoronichepatitistissuesandnormallivertissuesbyimmunohistochemistry.DetailedanalysisofAPE1expressionwithclinicopathologicparameterswasperformed.ResultsAPE1wasmainlydetectedinnucleiofpara-carcinomatissues,para-carcinomachronichepatitistissuesandnormallivertissues.WhileAPE1expressedinbothnucleusandcytoplasmonlyfoundinHCCandmetastatictumor().AstatisticsignificanttycorrelationbetweenthepositivedegreeofAPE1expressioninbothnucleusandcytoplasmwithhistologicalgradeofHCCandmetastasis().Furthermore,thepositivedegreeincytoplasmwascorrelatedwithcapsuleinvasion().ConclusionTheexpressionofAPE1isassociatedwiththemalignantphenotypeofHCC.OverexpressionandcytoplasmlocalizationofAPE1canbeusedasapoorlyprognosticmarkerforHCC.

KEYWORDS:carcinoma,hepatocelluar;endonucleases;microchipanalyticalprocedures;immunohistochemistry;prognosis

肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一,其癌變是一個多步驟的漸進過程,與慢性肝臟損傷、肝炎和肝硬化有關。脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1(APE1)是一種多功能的堿基切除修復途徑的關鍵酶,具有脫嘌呤/脫嘧啶位點(AP位點)核酸內切酶(APE)活性,修復烷化劑、氧自由基、電離輻射等因素產(chǎn)生的DNA損傷。AP位點是DNA最常見的損傷位點之一,具有細胞毒性和基因毒性,若不能修復,可阻礙DNA的復制,導致基因突變、染色體微衛(wèi)星不穩(wěn)定性或細胞凋亡,最終可導致腫瘤的發(fā)生。APE1又名氧化還原因子1(Ref-1),可調節(jié)許多轉錄因子的DNA結合活性,參與細胞增殖、分化和細胞凋亡等多種關鍵的細胞反應。筆者采用組織芯片技術檢測APE1在HCC、轉移灶中的表達情況,分析APE1表達與HCC臨床病理因素的關系。

1對象與方法

對象

收集福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1998—2006年手術切除標本,其中HCC126例,癌旁肝硬化組織(距癌組織2cm,鏡下無癌)95例,癌旁慢性肝炎組織(距癌組織5cm)46例,肝內外轉移灶29例,術前均未化療及放療。男性114例,女性10例,≥60歲28例,＜60歲96例。根據(jù)《中國常見腫瘤診治規(guī)范》對腫瘤進行組織學分類:梁狀型、假腺管型、實體型、硬化型。根據(jù)Edmondson組織學分級法進行病理學分級分為I~Ⅳ級,并判斷有無包膜癌浸潤和發(fā)生肝內外轉移。根據(jù)腫瘤大小和數(shù)量分為3組:腫瘤直徑3cm,腫瘤直徑3~5cm,腫瘤數(shù)量2個或直徑5cm。另收集正常肝組織5例,來源于1998-2006年福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術切除的肝血管瘤的瘤旁肝組織。

方法

鼠抗人APE1mAb(克隆號13B8E5C2,美國NovusBiologicals公司),工作濃度1∶18000;Elivisionplus免疫組織化學試劑盒(Kit-9901,福州邁新生物科技有限公司)。按照免疫組織化學Elivisionplus二步法試劑盒說明操作,DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對照。

制作組織芯片

根據(jù)研究目的設計點陣,選擇典型區(qū)域在玻片和相應蠟塊做標記。將本研究小組已制成的定位板蓋在受體蠟塊上［1］,按照定位板的點陣打孔,并從供體蠟塊已標記的典型區(qū)域鉆取組織,每個區(qū)域3個組織孔,轉移到受體蠟塊的承載孔。將組織芯片和周圍蠟質加熱融合。

結果判斷

參照Bamberger等的半定量積分法［2］,在光鏡下分別對陽性染色細胞數(shù)和染色強度進行判定。取表達最強的部分,按著色程度計分,無著色者為0分;淺黃色、略高于背景者為1分;棕黃色、明顯高于背景者為2分;強染、棕褐色者為3分。同時按陽性細胞數(shù)計分,≤5％為0分,6％~25％為1分,26％~50％為2分,51％~75％為3分,75%為4分。兩項相加后分4級:0~1分為陰性(－),2分為陽性(＋),3~4分為中等陽性(),5分以上為強陽性()。取各點的平均值綜合判斷。

統(tǒng)計學處理

采用SPSS統(tǒng)計軟件分析,選用參數(shù)秩和檢驗對兩個樣本半定量等級資料進行分析,選用Kurskal-WallisH檢驗對多個樣本半定量資料進行分析,選用Spearman秩相關進行指標間的相關分析。

2結果

組織芯片免疫組織化學封片后觀察,部分組織有脫片,以每個病灶的3個點(至少有2個點)滿足研究需求為標準,否則剔除該病例。126例HCC中2例由于組織脫落不能進行分析,其余124例均進入有效分析。

APE1定位表達

APE1蛋白在各組織的定位表達見表1。不同實驗組APE1表達方式不同,在正常肝組織、癌旁肝炎組織和癌旁肝硬化組織,APE1主要以細胞核表達為主;在HCC和轉移灶,APE1主要以細胞質和細胞核聯(lián)合表達為主,顯微鏡下觀察到細胞質和細胞核均出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1A)。124例HCC中,44例為單純細胞核染色,鏡下僅在細胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1B)。表1各組APE1蛋白的定位表達

APE1的半定量表達

各組細胞核和細胞質著色強度見表2。表2各實驗組APE1蛋白的半定量表達

APE1表達與HCC臨床病理因素的關系

隨著病理組織學分級的升高,APE1細胞核陽性強度依次增高(rs=,P=),細胞質陽性強度亦有依次增高(rs=,P=)。包膜浸潤組與包膜無浸潤組相比,細胞質陽性強度具有顯著差異(),而細胞核陽性強度無差異。與無腫瘤轉移組相比,腫瘤轉移組中細胞核陽性強度明顯升高(P=)。細胞質陰性染色13例,占轉移陽性組的％,其他3種染色強度結果均低于陰性染色組。APE1表達與年齡、性別、腫瘤大小、組織學分型無關(表3)。表3APE1蛋白表達與HCC臨床病理特征的關系

3討論

本研究采用組織芯片和免疫組織化學相結合,檢測APE1在HCC的表達,節(jié)約實驗成本,大大提高實驗效率,并保證實驗條件的同一性,減少了因普通實驗方法中分批、分次實驗造成的實驗誤差,提高了實驗結果的可靠性。同時,通過對手工制作組織芯片的方法進行改良,應用改良的打孔針和取材針,提高芯片制作的效率和質量,使檢測APE1表達的實驗系統(tǒng)更符合觀察和進一步研究需要。

APE1是一個具有雙功能的限速酶,既負責修復各種因素產(chǎn)生的AP位點,又通過保持許多轉錄因子(如p53、NF-κB、Pax-5、Pax-8、Hif-1、CREB、ATF和Hlf等)DNA結合區(qū)域特異性半胱氨酸的還原狀態(tài),維持轉錄因子的激活還原態(tài),從而調節(jié)DNA結合活性,發(fā)揮重要作用。以上兩種功能的異常均可導致腫瘤的發(fā)生。

在人體細胞中,APE1的表達可以細胞質型、細胞核型、細胞質/細胞核型3種模式存在。既往研究在卵巢癌、皮膚惡性黑色素瘤和結腸癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn),正常組織中APE1以細胞核表達為主,腫瘤組織以質核聯(lián)合表達為主,APE1表達定位的改變與腫瘤的惡性轉化密切相關［3-5］。本研究結果顯示,質核聯(lián)合表達方式比例在癌旁肝炎組織和癌旁肝硬化組織、HCC和轉移灶組依次遞增,正常肝組織未見質核聯(lián)合表達方式,差別具有統(tǒng)計學意義,提示HCCAPE1蛋白表達定位的改變,即從細胞核表達方式轉變成細胞質表達方式,具有重要意義。細胞質表達方式的出現(xiàn),可能與腫瘤的侵襲、轉移有關。該結果與以往對肺癌、乳腺癌的相關研究結果一致［6-7］。

目前,對APE1的定位表達機制尚缺乏明確的論述。Tell等研究發(fā)現(xiàn),各種導致APE1表達增強的應激因素(如UV、HBV、HCV和ROS等),可參與調控APE1在細胞內運輸［8］。APE1在惡性腫瘤中的細胞質定位,可能是外來因子造成了線粒體內的DNA損傷,在線粒體內出現(xiàn)了DNAAP位點的修復。因此,推測APE1在惡性腫瘤中的定位機制與其所受的應激有關。本研究發(fā)現(xiàn)APE1在HCC中主要定位于細胞質,而HBx是引起APE1移位至細胞質的主要損傷因子,推測HCC中APE1在細胞質表達與HBx損傷有密切關系。

Vittorio等發(fā)現(xiàn),低分化肝細胞癌與高分化肝細胞癌相比,APE1細胞質染色強度明顯增強［9］。在腦星形細胞腫瘤中發(fā)現(xiàn),Ⅲ、Ⅳ級腫瘤的APE1核表達陽性強度顯著高于Ⅰ、Ⅱ級,并與腫瘤復發(fā)有關［10］,進一步提示APE1的表達增強與腫瘤的惡性分化具有明顯關系。本研究結果顯示,細胞核表達陽性強度和細胞質表達陽性強度在各實驗組中不同。在正常組、癌旁肝炎組、癌旁肝硬化組、HCC組和轉移組同樣分別呈依次遞增趨勢(P＝)。因此認為APE1過表達與HCC發(fā)生、發(fā)展密切相關。進一步分析APE1表達水平與臨床各病理參數(shù)之間的關系,結果顯示APE1細胞核和細胞質陽性強度與腫瘤病理學分級、有無肝內外轉移灶密切相關,后者還與包膜有無腫瘤浸潤有關。APE1在細胞質和胞核過表達均與HCC的惡性臨床表型有密切關系。

Puglisi等研究結果顯示,APE1蛋白的細胞質定位與肺癌、乳腺癌的不良預后有關［6-7］。由于本研究尚缺乏完整的隨訪資料,未能對APE1蛋白的表達與預后的關系進行直接論述,但本研究顯示,APE1的細胞質表達與腫瘤的轉移有關,且APE1過表達還與包膜侵犯和病理學分級有關系,而這些參數(shù)與HCC的侵襲力和預后均有非常密切的關系。因此推測,APE1蛋白的細胞質表達及細胞質+細胞核過表達可能與HCC的預后有關。

對HCC中APE1表達特點的研究具有重要意義,其細胞質表達方式的出現(xiàn)和陽性強度的變化,可作為判斷HCC患者預后和腫瘤惡性表型的指標之一。

【參考文獻】

［1］臧盛兵,黃愛民,高凌云,等.手工制作組織芯片方法的改良及其在肝細胞癌研究中的應用［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2007，16:385-388.

［2］BambergerAM,RiethdorfL,Milde-LangoschK,etal.Stronglyreducedexpressionofthecellcycleinhibitorp27inendometrialneoplasia［J］.VirchowsArch,1999,434(5):423-428.

［3］TannerB,GrimmeS,SchifferI,etal.Nuclearexpressionofapurinic/apyrimidinicendonucleaseincreaseswithprogressionofovariancarcinomas［J］.GynecolOncol,2004,92(2):568-577.

［4］YangS,IraniK,HeffronSE,etal.Alterationsintheexpressionoftheapurinic/apyrimidinicendonuclease-1/redoxfactor-1(APE/Ref-1)inhumanmelanomaandidentificationofthetherapeuticpotentialofresveratrolasanAPE/Ref-1inhibitor［J］.MolCancerTher,2005,4(12):1923-1935.

［5］牟江洪,肖華亮,向德兵,等.大腸癌Ref-1/APE的表達特點及其意義［J］.第三軍醫(yī)大學學報,2006,28(2):111-113.

［6］PuglisiF,AprileG,MinisiniAM,etal.PrognosticsignificanceofApe1/ref-1subcellularloca