基因操作技術(shù)詳解演示文稿

基因操作技術(shù)詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點優(yōu)選基因操作技術(shù)目前二頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點

第一節(jié)

DNA克隆

1DNA克隆克隆是指遺傳上同一的生物體群體或由無性繁殖所產(chǎn)生的無性繁殖系(如株系,細(xì)胞系,菌株)DNA克隆是指含有相同DNA分子或DNA片段的的細(xì)胞群體.通過分離基因組DNA,擴增某個特定DNA片段,轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中增殖，可制備出一個特定DNA克隆.

DNA制備是DNA克隆及其他DNA操作的第一步驟.DNA克隆的基本程序如下:目前三頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點DNA提取

→

分離和擴增特定DNA片段(PCR)

載體連接

↓

↓

重組體DNA

↓轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞

↓

細(xì)胞培養(yǎng)(細(xì)胞克隆)

克隆篩查↓(分子雜交)

↓

靶DNA克隆

↓

表達分析與功能分析

目前四頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點1.1DNA制備(提取)

組織細(xì)胞---→研磨破細(xì)胞---→

萃取

↓↓離心↓

分離

↓純化↓DNA樣品(

WithDNA

)目前五頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點1.2DNA擴增(PCR)目前六頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點1.3

轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是把外源DNA（重組體DNA）轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中復(fù)制的過程。靶DNA

重組載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞

分子克隆載體DNA目前七頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點2宿主細(xì)胞,載體及亞克隆宿主?宿主生物或細(xì)胞能夠高速率復(fù)制外源DNA.?

多數(shù)宿主是細(xì)菌(如E.coli),培養(yǎng)細(xì)胞或原生質(zhì)體.

?

宿主細(xì)胞通常需經(jīng)感受態(tài)處理才能吸收外源DNA.

載體?載體是獨立于宿主細(xì)胞的復(fù)制子.

?載體易分離,帶有選擇標(biāo)記,并容易插入外源DNA.

?

常用的載體有:質(zhì)粒,噬菌體,粘粒,細(xì)菌人工染色體和酵母人工染色體.目前八頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點亞克隆:

亞克隆是從一個載體中將特定克隆DNA片段轉(zhuǎn)移到另一載體的過程.克隆DNA分離→

限制酶切

→靶DNA片段分離收集

靶DNA片段純化

→

載體連接

轉(zhuǎn)化,篩選,克隆分析

亞克隆目前九頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點3DNA文庫

DNA文庫由一個基因組的全部DNA克隆所構(gòu)成,每個DNA克隆含有基因組DNA(基因組文庫)或總cDNA(cDNA文庫)的一個隨機片段.

?基因組文庫:

基因組DNA→隨機片段→重組體DNA→轉(zhuǎn)化↓

基因組DNA克隆

?cDNA文庫:

提取總mRNA→反轉(zhuǎn)錄為cDNA→重組體DNA

↓

轉(zhuǎn)化

↓

cDNA克隆

vectors目前十頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點基因文庫篩選是用分子探針或特殊蛋白質(zhì)從基因文庫中尋找特定DNA克隆的過程.DNA探針

每一克隆DNA

分子雜交(SouthernorWesternblot)

檢測與定性

克隆分析:結(jié)構(gòu)(序列)分析,功能分析(編碼蛋白質(zhì))

比對分析(同源基因).目前十一頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點第二節(jié)質(zhì)粒載體制備DNA載體是能獨立復(fù)制并能插入外源DNA的小分子DNA理想載體的要求:

?高復(fù)制率;

?多個限制性內(nèi)切酶識別位點(每種酶一個識別位點);

?帶有選擇性標(biāo)記(克隆篩選標(biāo)記和重組體篩選標(biāo)記);

?能容納較大的DNA片段插入.質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的小DNA分子,是最早用于基因操作的載體分子,主要用于攜帶外源基因進入細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制和表達.通常將攜帶外源基因的載體稱為重組載體

(重組DNA)目前十二頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點1質(zhì)粒?質(zhì)粒是染色體外的環(huán)狀DNA分子.

絕大多數(shù)質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌細(xì)胞中,但對細(xì)菌的代謝和生命周期是非必需的.

?質(zhì)粒的存在可能賦予宿主細(xì)胞一些特性,如抗藥性、耐逆性、接合性等.

?質(zhì)粒能獨立于宿主DNA復(fù)制.

?質(zhì)粒賦予宿主的一些特性,可作為選擇性標(biāo)記.?質(zhì)粒根據(jù)其復(fù)制特性可分為兩類:

嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(低復(fù)制率);

松馳型質(zhì)粒(高復(fù)制率).

目前十三頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點重組體篩選

雙標(biāo)記,負(fù)選擇目前十四頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點重組體篩選

藍(lán)白斑目前十五頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點2質(zhì)粒制備

培養(yǎng)含所需質(zhì)粒的細(xì)菌株系;離心收集細(xì)菌沉淀物,再懸浮;堿裂解部分破壁增加細(xì)胞透性:

懸浮培養(yǎng)→裂解液→中和→離心→收集上清液

酚萃取除去蛋白質(zhì);乙醇沉淀,收集質(zhì)粒DNA;DNA純化:CsCl2

梯度離心(大量制備用)

緩沖液溶解,酚/仿萃取,乙醇沉淀

目前十六頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點質(zhì)粒

DNA

制備工藝目前十七頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳+目前十八頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點第三節(jié)限制性內(nèi)切酶及酶切片段凝膠電泳1限制性DNA內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶催化從DNA分子內(nèi)部水解磷酸二酯鍵,切斷雙鏈DNA限制性內(nèi)切酶有特定的識別位點,且不同的限制性內(nèi)切酶的識別位點的序列各不相同.

限制

-

修飾系統(tǒng)是生物體的主要防御機制:

?限制性內(nèi)切酶在特定位點切割外來DNA,切割后的DNA片段再被其他的DNase完全水解;?甲基化酶給自身DNA的識別位點上的C或A堿基加上甲基,使限制性內(nèi)切酶不能催化該位點DNA水解,從而保護宿主DNA免受破壞.

目前十九頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點限制性內(nèi)切酶的分類:TypeI有特定識別位點但隨機切割.TypeII有特定識別位點且在同一位置切割.TypeIII有特定識別位點但在之外幾個堿基處切割DNA.

限制性內(nèi)切酶TypeII

的作用特點：識別位點是回文序列.切割后產(chǎn)生粘性末端(3`-突出或5`-突出),可進行退火堿基配對并用DNA連接酶修復(fù)連接.少數(shù)限制性內(nèi)切酶切割后可產(chǎn)生平端(鈍端),須用特殊的DNA連接酶(如T4

DNA連接酶)連接.目前二十頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點

目前二十一頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點2瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)體系:瓊脂糖(0.5-2.0%);緩沖液(約pH8.0);DNA樣品(上樣緩沖液

+

DNA

+

EB

或其他染色劑);電場(

約100V

).目前二十二頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點注意事項:在高pH條件下,所有DNA分子在緩沖液中均帶負(fù)電荷,在電泳過程中將向正極遷移.遷移率與DNA分子的大小(長度)成正相關(guān).相同大小的DNA在超螺旋狀態(tài)下的電泳遷移快于線性DNA和環(huán)狀DNA,線性DNA的電泳遷移快于環(huán)狀DNA.較大的DNA分子須在較低濃度的凝膠上進行電泳,較小的DNA分子可用較高濃度的凝膠.當(dāng)DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合時,其電泳遷移明顯地減緩（凝膠阻滯）.目前二十三頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點Electrophoretogram酶切片段的電泳分離目前二十四頁\總數(shù)二十八頁\編于十三點從瓊脂糖凝膠中分離特定的DNA片段:

?切膠,熔解凝膠和去除EB;

?酚/仿萃取、離心收集和純化DNA。

熔膠和去EB

Tar