免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)(副本)

免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)(副本)第一頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblot

二、原理

蛋白質(zhì)(病毒、細(xì)菌蛋白)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），根據(jù)相對(duì)分子量的大小分成區(qū)帶，然后通過轉(zhuǎn)移電泳將SDS上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維濾膜上加上相應(yīng)的標(biāo)記抗體（如酶標(biāo)抗體、膠體金標(biāo)記抗體、熒光抗體、放射性同位素標(biāo)記抗體），也可先加抗體反應(yīng)，再加標(biāo)記的抗抗體，通過對(duì)抗體的標(biāo)記物的檢測(cè)，以分析特異性抗原蛋白區(qū)帶。第二頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblot三、基本步驟（一）目的蛋白的分離1、經(jīng)過純化的目的蛋白直接進(jìn)入下一步2、未經(jīng)過純化的目的蛋白需進(jìn)行分離a、SDS（根據(jù)相對(duì)分子量）b、等點(diǎn)聚焦電泳（根據(jù)pI）第三頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblot

（二）轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)印就是將蛋白質(zhì)由SDS凝膠上轉(zhuǎn)移到固相支持物上。首選的固相支撐物是硝酸纖維濾膜（NC膜）第四頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblot

1、半干電轉(zhuǎn)印法：將凝膠和固相基質(zhì)以三明治樣夾在緩沖液浸潤(rùn)的濾紙中，電轉(zhuǎn)印10-30min2、濕法電轉(zhuǎn)印法：將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間浸在轉(zhuǎn)印裝置的緩沖液中，通電轉(zhuǎn)印45min或過夜第五頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblotting（三）免疫檢測(cè)1、NC膜的封閉為防止NC膜的非特異性背景著色，用封閉液對(duì)NC膜進(jìn)行封閉。常用的封閉液為加有脫脂奶粉、小牛血清或牛血清白蛋白的緩沖液。第六頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblotting

2、靶蛋白與特異性抗體（一抗）反應(yīng)將可識(shí)別靶蛋白的McAb或PcAb與NC膜一同溫育。3、靶蛋白與標(biāo)記的二抗反應(yīng)待上步反應(yīng)結(jié)束后，洗滌NC膜，使之與標(biāo)記的二抗反應(yīng)，二抗可用放射性同位素、酶、生物素、膠體金等標(biāo)記。第七頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblot4、指示反應(yīng)根據(jù)標(biāo)記物的不同，可采用放射自顯影、底物顯色等，在NC膜上顯示相應(yīng)的檢測(cè)蛋白帶第八頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblot

四、Westernblot中應(yīng)該注意的問題（一）首先應(yīng)該確定檢測(cè)蛋白經(jīng)SDS和還原劑處理后，其抗原決定簇仍然可與相應(yīng)的抗體結(jié)合。特別是在用單克隆抗體作為第1抗體時(shí)應(yīng)考慮這一點(diǎn)。第九頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblot

（二）要保證檢測(cè)所用抗體的特異性，尤其是一抗的特異性更為重要。另外，對(duì)一抗和標(biāo)記體的使用濃度，通常要根據(jù)實(shí)際情況作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。第十頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblot

（三）實(shí)驗(yàn)操作過程中，拿取凝膠、濾紙和NC膜的時(shí)候，必須戴手套，因?yàn)槠つw上的油脂和分泌物會(huì)阻止蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到濾膜上。第十一頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblot

（四）轉(zhuǎn)印時(shí)要注意電流的大小，過高的電流產(chǎn)生的熱量會(huì)在凝膠和NC膜之間形成氣泡，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)印的失敗。有報(bào)道，在轉(zhuǎn)印緩沖液中加入20%的甲醇，雖然降低蛋白質(zhì)的洗脫效率，但可以提高其與硝酸纖維素結(jié)合的能力?；蛘呖梢栽诰彌_液中加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS,也可以提高轉(zhuǎn)印效率。第十二頁(yè)，共15頁(yè)。Westernblot

五、應(yīng)用免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)是蛋白質(zhì)組分分析和蛋白多肽相對(duì)分子質(zhì)量分析的主要方法，已廣泛用于病毒蛋白和基因表達(dá)重組蛋白多肽的