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文檔簡(jiǎn)介
醫(yī)學(xué)突破的先鋒-CRISPR介導(dǎo)的HeLa細(xì)1952年,HenriettaLack(HeLa)細(xì)胞成為第一個(gè)可以在實(shí)驗(yàn)室中無(wú)限傳代的人類細(xì)胞系,而這些細(xì)胞被科學(xué)家們標(biāo)記為“永生的"。研究人員最初是從侵襲性官頸癌腫瘤中提取出的HeLa細(xì)胞。這些細(xì)胞在不斷供應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)下持續(xù)繁殖,并在不到24小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)出新一代的細(xì)胞。與許多腫瘤一樣,Hela細(xì)胞具有錯(cuò)誤組成的基因組,其中多個(gè)染色體有一個(gè)或多個(gè)拷貝:正常細(xì)胞有46條染色體,而Hela細(xì)胞包含76至80條染色體,其中一些染色體嚴(yán)重突變。同時(shí),這些細(xì)胞還表達(dá)了過(guò)反應(yīng)性端粒酶,即每次分裂后重建端粒,防止細(xì)胞衰老,以允許HeLa細(xì)胞無(wú)限傳代。HeLa細(xì)胞系為許多醫(yī)學(xué)突破都做出了貢獻(xiàn),從研究太空零重力效成和脊髓灰質(zhì)炎疫苗的開(kāi)發(fā),到白血病、皿病病毒和癌癥的全球性研究。盡管現(xiàn)在有許多其他細(xì)胞系也在使用,但自HeLa細(xì)胞被分離以來(lái),HeLa細(xì)胞在當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的大多數(shù)領(lǐng)域都取得了一定的進(jìn)展,尤其是在癌癥生物學(xué),傳染病,基礎(chǔ)微生物學(xué)等領(lǐng)域都取得了一些重大進(jìn)展。涉及HeLa細(xì)胞的研究已經(jīng)在超過(guò)11000份科學(xué)刊物中描述過(guò),其中包括三份獲得過(guò)諾貝爾獎(jiǎng)的:2008年發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒(HPV)是宮頸癌的致病因子;2009年發(fā)現(xiàn)端粒酶可以保護(hù)染色體的端粒,從而防止染色體的降解,和2014年促進(jìn)在細(xì)胞生長(zhǎng)方面的實(shí)時(shí)觀察。這個(gè)驚人的數(shù)字清晰地表明這些細(xì)胞在過(guò)去六十年中對(duì)研究的重要性。HeLa細(xì)胞的多功能性和強(qiáng)大功能使其成為必不可少的實(shí)驗(yàn)室工具,繼續(xù)為人類健康與疾病的基礎(chǔ)提供新的線索。HeLa細(xì)胞是熱門的細(xì)胞模型之一,也是生命科學(xué)家的工具,去研究疾病或治療活性藥物分子的作用機(jī)制,以及破譯細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo),如DNA損傷修復(fù)。研究人員選擇HeLa細(xì)胞作為多學(xué)科研究的工具,因?yàn)樗哂杏郎募?xì)胞特征,可適用于多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(基因組學(xué),蛋白質(zhì)組學(xué),和轉(zhuǎn)錄組學(xué)),并且易于利用這些數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)設(shè)計(jì)和改進(jìn)研究項(xiàng)目。最近的一項(xiàng)研究就是利用HeLa細(xì)胞研究SARS-CoV-2病毒在人體中的感染性。研究COVD-19的科學(xué)家們使用HeLa細(xì)胞以確定病毒用于進(jìn)入人體細(xì)胞的受體?;趯?duì)HeLa細(xì)胞的研究,新型冠狀病毒的研究取得了前所未有的進(jìn)展。應(yīng)用范HeLa細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展成為研究各種課題的有用模型。源自HPV轉(zhuǎn)化的宮頸腺癌細(xì)胞的HeLa細(xì)胞已被用于各種研究,包括但不限于癌癥的研究。作為一種腫瘤模型,它們已被廣泛應(yīng)用于研究中:腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲藥物開(kāi)發(fā)細(xì)胞死亡途徑CRISPR-U?基因編輯在HeLa細(xì)胞的應(yīng)用CRISPRCRISPR-Cas系統(tǒng)已經(jīng)成為了革命性的基因組編輯工具,為生命科學(xué)的發(fā)展和我們對(duì)生命的理解提供了巨大的動(dòng)力。CRISPR系統(tǒng)用于精確的基因組編輯,可以通過(guò)用所需的供體序列取代靶基因序列來(lái)進(jìn)行基因敲除或敲入基因組的操作。HeLa細(xì)胞是一種侵襲性宮頸癌細(xì)胞系。在HeLa細(xì)胞系中進(jìn)行基因編輯可以產(chǎn)生單個(gè)或多個(gè)基因敲除,正確的突變或插入報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因。這些經(jīng)過(guò)基因組編輯的HeLa細(xì)胞系將提供給研究人員用于研究癌癥,癌癥治療,細(xì)胞死亡,功能基因組學(xué),信號(hào)通路,藥物研發(fā),藥物反應(yīng)和細(xì)胞治療。
單克隆擴(kuò)增和凍存(提供細(xì)胞鑒定報(bào)告)細(xì)胞檢測(cè)及培養(yǎng)(提供細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告)單克隆形成陽(yáng)性克隆鑒定
(基因編輯效率提升10倍)圖:針對(duì)工程ESC和iPSC的CRISPR-U?定制流程源井生物自主研發(fā)的CRISPR-U?可用于HeLa細(xì)胞系的基因操作。因此,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在HeLa細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因組編輯。源井生物可以定制真核HeLa細(xì)胞中的基因編輯,也可以在動(dòng)物模型中進(jìn)行各種基因改造。單克隆擴(kuò)增和凍存(提供細(xì)胞鑒定報(bào)告)細(xì)胞檢測(cè)及培養(yǎng)(提供細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告)單克隆形成陽(yáng)性克隆鑒定
(基因編輯效率提升10倍)源井生物自主研發(fā)的CRISPR-U?技術(shù)優(yōu)化了真核細(xì)胞和動(dòng)物基因編輯載體和過(guò)程。效率和準(zhǔn)確度比傳統(tǒng)方法提高了10倍。馬上聯(lián)系我們,了解與您研究相關(guān)的服務(wù)吧!基因敲除Hela的研究案例:CRISPR/Cas9介導(dǎo)的TERT的紊亂可抑制腫瘤細(xì)胞的存活端粒是真核細(xì)胞中維持染色體完整性的一種獨(dú)特結(jié)構(gòu)。哺乳動(dòng)物的端粒長(zhǎng)度主要受端粒酶的調(diào)控,而端粒酶是一種核糖核蛋白,由逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和RNA亞基(TERC)組成。TERC在所有細(xì)胞中都有組成性表達(dá),而TERT的表達(dá)則是在大多數(shù)成年體細(xì)胞中受到時(shí)間和空間上的調(diào)控。在體細(xì)胞中,TERT被滅活,因此端粒酶活性不會(huì)被檢測(cè)到。而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞通過(guò)激活TERT的機(jī)制來(lái)阻止進(jìn)行性端粒侵蝕以實(shí)現(xiàn)增殖永生。因此,TERT失活被認(rèn)為是一種很有前景的腫瘤治療手段,研究人員利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)來(lái)靶向癌細(xì)胞中的TERT基因。為此,他們選擇了三種不同的癌細(xì)胞系:宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)、胰腺癌細(xì)胞系(PANC1)和乳腺癌細(xì)胞系(SUM159),并設(shè)計(jì)了三個(gè)分別針對(duì)人類TERT基因外顯子2(E2)、夕卜顯子4(E4)和夕卜顯子6(E6)的gRNAs(sg1、sg2和sg3)。研究人員進(jìn)一步設(shè)計(jì)了另外兩個(gè)靶向TERT夕卜顯子4(E4)側(cè)翼內(nèi)含子的gRNAs(sg4和sg5)來(lái)產(chǎn)生KO-TERT細(xì)胞。在單倍劑量不足的研究中,突變的TERT細(xì)胞端粒酶活性降低,端粒變短。與WTPE-Hela細(xì)胞相比,細(xì)胞增值測(cè)■、細(xì)胞培養(yǎng)密度和更強(qiáng)的陽(yáng)9那染色信號(hào)都顯示出突變的TERT細(xì)胞產(chǎn)生了嚴(yán)重的細(xì)胞衰老。AnnexinV和PI染色也提供了細(xì)胞凋亡的證據(jù):突變的TERT細(xì)胞比WTPE-Hela細(xì)胞具有更高的凋亡率;在體外腫瘤細(xì)胞中缺乏TERT單鏈則導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)遲緩和加速死亡。WTPfTERT*LU*喜號(hào)也1蘭母3<,附呻圖1:Tert+/-癌細(xì)胞生長(zhǎng)遲緩,細(xì)胞加速死亡。(A)WT和TERT+/-Hela細(xì)胞的群體倍增時(shí)間。(B)第2代(P2)、P5和P7代WT和TERT+/-Hela細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡圖像。(C)WT和TERT+/-Hela細(xì)胞的&-gal染色。箭頭指示嚴(yán)重衰老細(xì)胞的例子。(D)LDH法測(cè)定WT和TERT+/-Hela細(xì)胞的細(xì)胞死亡率。(E)流式細(xì)胞術(shù)定量分析annexin-V和碘化丙啶(PI)染色對(duì)WT和TERT+/-Hela細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。**p<0.01。WTPfTERT*LU*喜號(hào)也1蘭母3<,附呻研究人員進(jìn)一步利用腫瘤異種移植的裸鼠模型研究7TERT單倍劑量不足對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活率的影響,并在接種后6周檢查異種移植物的大小。正如預(yù)期,WTPE-Hela細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)成直徑約2cm的腫瘤塊而TERT突變的Hela細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)未能形成任何的腫瘤塊,這一結(jié)果證明了Cas9介導(dǎo)的TERT單倍劑量不足可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。9V'茉好工尊用,舌風(fēng)回玄茸秘必ISN'M印°(卸)VISN□i(W)H-ISN區(qū)好ISN'食螭風(fēng)乃至舌工砌郢部?;谺hk*中覃詢菜Y址昌丑盅莘+ISN刖喇詢(Bl/\ll/\l)BSI2H融VNOEtflSrWSW^W(ISI/J)辿ri__*J辿ri__*Jtt王/串EK利善弄圃16部丫做基麟覃ZHSN科肇蠢Y值6SBDAidSniD:磁■蓉岬BPH阿鄲睛屋蟾*址昔風(fēng)M豐閽避丑醐甌率H-/+輜丑也_LM:乙國(guó)EQgkO9仲□05L席665?!^#EQgkO9仲□05L席665?!^#auD|\|?nmimiimuauo^l.mpllklllillplllpjl況心卜」.HTWiHinniiiiiniiii_■A_如%?」駟座7*^313dlM-/4.LH313d_LM-/41H313dLAA-/41W3LIdlM岫H說(shuō)11面penUS"I1U6隊(duì)職1
早前的一項(xiàng)研究表明,MMR基因敲除小鼠中的腫瘤并未表現(xiàn)出MSI-H腫瘤中典型的劇烈微衛(wèi)星變化(即B型),而是小而細(xì)微的改變(即A型)。林奇綜合征(LS)被稱為遺傳^浦肉性結(jié)直腸癌(HNPCC),S?傳性結(jié)腸癌(結(jié)腸癌)的最常見(jiàn)原MLHL,MSH2,MSH6,PMS2和EPCAM這些基因的突變是造成林奇綜合征的因素。在這項(xiàng)研究中,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將林奇綜合征(LS)中的MSH2突變引入到HeLa細(xì)胞中。研究人員使用基因組編輯載體pSpCas9(BB)-2A-Puro(pX459),gRNA(由CRISPR-direct和CRISPR設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì))并使用BbsI位點(diǎn)亞克隆到pX459中。使用Lipofectamine2000將編碼gRNA的pX459質(zhì)粒和三種不同的單鏈ssODN共同轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。產(chǎn)生的突變克隆清楚地表現(xiàn)出具有烷化劑耐受性和突變頻率升高的MMR缺陷表型。然而,微衛(wèi)星并沒(méi)有像MSI-H腫瘤在林奇綜合征患者中表現(xiàn)得那么顯著地不穩(wěn)定,且所有觀察到的變化均為A型,而這恰恰證實(shí)了小鼠的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)表明人類基因組中重復(fù)不穩(wěn)定的分子機(jī)制是更加復(fù)雜的。腸癌(結(jié)腸癌)的最常見(jiàn)原MLHL,MSH2,MSH6,PMS2和EPCAMATP睥HMisrnaicnbindingWalkerAEcdifGPNKMGI.'KSMSH2L&wrH,s&pJertsM.muscufus071TWTATt;ZCT:AAATCkNWU.K£JMefIIG674RAATATGCGTAAATCA8GKST&mAlG674DAikTATCGQAGACAAATCXJSuKSAji|G674AAATATGGGAGCTATP睥HMisrnaicnbindingWalkerAEcdifGPNKMGI.'KSMSH2L&wrH,s&pJertsM.muscufus071TWTATt;ZCT:AAATCkNWU.K£JMefIIG674RAATATGCGTAAATCA8GKST&mAlG674DAikTATCGQAGACAAATCXJSuKSAji|G674AAATATGGGAGCTAAATCA.MGAKSGFM阡】3-琦□KSs&ODN(Gfi74R):§B-S8Q&N{G674D):..AFiTATG-3GA':5AC^ATC^..G674D(DA02)G674R(RODS)53&&N^O574AJ:9.…心mTGGmGCT心ES..章TT海G.TG674A(AG11)這項(xiàng)研究已成功獲取了MSH2突變的HeLa克隆,并且這些已建立的克隆明顯表現(xiàn)出具有烷化劑耐受性和升高的突變頻率的MMR缺陷表型。盡管在這些克隆■n,中,微衛(wèi)星并未像林奇綜合征患者中的腫瘤那樣表現(xiàn)出明顯不穩(wěn)定。目前的發(fā)表明,除了MMRtme外,以前無(wú)法識(shí)別出的分子機(jī)制可能是人類細(xì)胞重復(fù)失穩(wěn)的根本基因敲入Hela的研究案例:■n,sgRNA的可逆遮蓋/揭開(kāi)策略(Cloaking/Uncloakingstrategy)可控制CRISPR-Cas9在體外和活細(xì)胞中的基因編輯效率RNA“遮蓋”(RNACloaking)是控制RNA雜交,折疊和酶促相互作用的溫和且可逆的一種化學(xué)方法。在這項(xiàng)研究中,研究人員使用疊氮化物取代的?;溥蛟噭∟AI-N3)在合成后?;疪NA的20-OH基團(tuán),導(dǎo)致RNA折疊,雜交和功能的阻斷。使用水溶性磷化氫處理后,此類聚?;āㄕ谏w”)RNA的體外活性可被有效修復(fù),這種水溶性磷化氫引起疊氮化物的施陶丁格還原反應(yīng),然后自發(fā)地失去?;āń议_(kāi)”)。研究人員用sgRNAs研究這些可逆的遮蓋/揭開(kāi)現(xiàn)象,來(lái)調(diào)控CRISPR-Cas9系統(tǒng)在體外和活細(xì)胞中的基因編輯效率對(duì)于體外研究,研究人員設(shè)計(jì)了一種體外基因編輯模型平臺(tái),該平臺(tái)具有103個(gè)核苷酸長(zhǎng)(nt)的合成sgRNA,是以Cy5標(biāo)記的雙鏈DNA(dsDNA)為靶點(diǎn)并編碼一部分的綠色熒光蛋白(GFP)。他們發(fā)現(xiàn),當(dāng)被“遮蓋”的sgRNA與三羥丙基膦(THPP)或二苯基膦苯-3-磺酸鹽(TPPMS)在濃度為1-5mM的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)緩沖液中于37°C培養(yǎng)1小時(shí)時(shí),得到了最高程度的Cas9介導(dǎo)的DNA切割——表現(xiàn)為在定量層面上活性被完全恢復(fù)到未處理sgRNA的水平。這種驚人的體外表現(xiàn)表明了該方法在CRISPR-Cas9診斷應(yīng)用中的控制時(shí)機(jī)和啟動(dòng)方面是有潛在用途的。對(duì)于體內(nèi)研究,研究人員使用了GFP陽(yáng)性的HeLa細(xì)胞,而這些細(xì)胞最初是通過(guò)核轉(zhuǎn)染或商用陽(yáng)離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染GFP靶向sgRNA和Cas9蛋白。他們進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn),基于與體外實(shí)驗(yàn)相同的步驟,用來(lái)測(cè)試〃遮蓋”由CART遞送的GFP靶向sgRNA是否能夠阻斷在GFP陽(yáng)性HeLa細(xì)胞中CRISPR-Cas9的基因組編輯。他們觀察到用“遮蓋”的sgRNA/Cas9mRNA轉(zhuǎn)染的GFP陽(yáng)性細(xì)胞與未處理的細(xì)胞有著相同的GFP熒光表達(dá)水平。這證實(shí)了sgRNA的?;旧献钄嗔嘶罴?xì)胞中的所有sgRNA的活性。因此,該研究強(qiáng)調(diào)了可逆RNA?;勺鳛橐环N新的方法來(lái)控制基因組編輯的功能。
dsDIMACleavageproduct*TargetDNA圖1:(a)NAI-N3抑制。RISPR-Cas9基因編輯的機(jī)制。sgRNA的“遮蓋”是通過(guò)Cas9核酸酶抑制RNA引導(dǎo)的DNA雙鏈切割(6)使用Cy5標(biāo)記的dsDNA和未處理的,“遮蓋”的和〃揭開(kāi)、未遮蓋”的(磷化氫處理的)sgRNA在體外的Cas9核酸酶測(cè)定的PAGE分析。(c)條形圖表示gRNA與Cas9s培養(yǎng)后的DNAdsDIMACleavageproduct*Tar
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