已結(jié)束課程-第19次課重組dna技術(shù)

第二十一重組 工 binationandGenetic DNA重組是指不同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生段并重新組合形成新DNA分子的過程 一、同源重組是最基本的DNA重組方發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的A重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)A分子以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)Holliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟兩個(gè)同

內(nèi)切

分支遷 內(nèi)切

連接

3′內(nèi)切

內(nèi)切5′ 5′3′

35′ 5′

連接

3′5′段重組

重組

3′5′

二、細(xì)菌 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化作通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源A，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型， 轉(zhuǎn)導(dǎo)作當(dāng)從被的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。λ第二重組DNA技又稱DNA克隆或分子克重組DNA技術(shù)的發(fā)展1865年G.J.Mendel1944年O.T.Avery 球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英 成功的克隆了多莉一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概（一）DNA克（即DNA克隆）應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我 能力的DNA分子—— (replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱克隆或重組DNA。（二）工具DNA聚合酶T4DNATaqDNA定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點(diǎn)或其Bam

Ⅱ類酶識別序列特點(diǎn)回文結(jié)構(gòu)切口：平端切口、粘端

Bam

+

平端切 粘端切 識別序列及切割位 識別序列及切割切割后產(chǎn)生５’突出末端Hae Kpn Bgl Pst EcoR Sph Hind 切割后產(chǎn)生平末端Hpa Alu Mbo EcoR Nde Hae 切割后產(chǎn)生3’突出末端Pvu Apa Sma （三）目 指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病組（四 載為攜帶目的，實(shí)現(xiàn)其無性繁克隆載體(cloning為使 的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自 特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主 傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。噬菌體λ噬菌體DNAλgt系列 二、重組DNA技術(shù)基本原理和步質(zhì) 噬菌

目 組 人工合 PCR產(chǎn)開環(huán)載體

限制酶消轉(zhuǎn) 體外包裝，轉(zhuǎn)篩表型篩 酶切電泳鑒 菌落原位雜（一）目 的獲化學(xué)合成 物的氨基酸序列。組DNA文庫(genomicDNAcDNA文庫(cDNA聚合酶鏈反應(yīng)(（二）克隆載體的選擇和構(gòu) （三）外 與載體的連粘性末端連(2)G

BamHⅠ切割反目 用BamHⅠ切G G

載體DNA用BamHⅠ切GGT4DNA連接載體自

重組

目 自EcoRⅠ切割位 BglⅡ切割位

EcoRⅠ+Bg雙酶

EcoRⅠ+Bg雙酶G

AT4DNA連接

+G+

重組平端連限制性內(nèi)切限制性內(nèi)切T4DNA連接重組 載體自 目自（四）重組DNA導(dǎo)入受體處于感受態(tài)(transfection)（五）重組體的標(biāo)志補(bǔ)救(marker藥插性藥插性入標(biāo)失記活選法()αα利用α互補(bǔ)原理篩選重組體（六）克 的表原核表達(dá)體系(E.coli表達(dá)體系最為常用標(biāo)準(zhǔn)：選