基因治療2014-1224課件

基因治療朱平北京大學第一醫(yī)院一、基因治療的發(fā)展由于人類的大多數疾病與基因的變異有關，隨著大量致病的突變基因被發(fā)現，基因克隆技術和基因轉移手段日益成熟，基因治療被認為是治愈疾病的最佳方式。

盡管真核細胞對抗外源的DNA有很多防御機制，大片密實的異染色質成為天然的屏障，1980年代就有報告提出，病毒可以作為傳遞基因的工具。我們經過臨床觀察發(fā)現致病基因的例證：

原發(fā)性血小板增多癥轉化為急性髓細胞白血病的克隆演變過程（中國實驗血液學雜志2012）

病例147歲，男，因“發(fā)熱并全身關節(jié)疼痛”1周。幾年前曾診斷為原發(fā)性血小板增多癥，JAK2突變，予以羥基脲、干擾素a-2b等藥物治療。入院時輕度貧血貌，血常規(guī)：WBC1.95×109/L，RBC2.46×1012/L，HGB90g/L，PLT251×109/L。骨髓確診急性髓細胞白血病。

對ET患者做單細胞全基因組外顯子測序，發(fā)現有不同惡性細胞同時存在多種基因突變的時期，其中一個細胞群有明顯的生長優(yōu)勢（克隆演化）。

82個惡性細胞18個突變的候選基因全世界的基因治療Bubbleboy病毒載體Miller設計的逆轉錄病毒載體是第一個被用于臨床試驗的載體。載體用包裝細胞株擴增，避免病毒產物的重組產生復制能力。加入包裝信號，改良滴度，獲得更多的載體。逆轉錄病毒(RV)

RNA病毒

優(yōu)點：1）能高效感染宿主細胞

2）可整合宿主染色體，隨細胞

分裂而傳代；

缺點：1）攜帶基因容量有限；

2）影響插入點附近的基因過度

表達或失活

3）只感染正在分裂的細胞；

腺相關病毒（AAV）

需要腺病毒的幫助才可以進行復制?？梢赞D染分裂和非分裂細胞，定點整合于宿主細胞染色體上。微小的病毒顆?？梢蕴颖芩拗鞯拿庖弑O(jiān)視，不易引起免疫反應。慢病毒載體（Lentivirus）

人類免疫缺陷病毒（HIV）含三個

結構基因（gag、pol、env）和

六個調控基因（tat、rev、vpr、

vpu、nef、vif）。構建重組病毒

載體時，僅保留LTR、包裝信號

和gag部分序列，病毒結構蛋白則由輔助病毒提供。

LV可在多種非分裂細胞進行高效的轉染和長期穩(wěn)定的基因表達，包括造血干細胞，以及終末分化的細胞，如神經元，肌肉細胞和肝細胞等。物理方法做基因轉移

包括磷酸鈣共沉淀、顯微注射法、微粒轟擊法（Particalbombardment）、電穿孔、脂質體法及利用細胞受體介導的基因轉移技術。

基因的電轉移基因槍三、臨床開始了基因治療早在1989NIH核準5位患者輸入基因標記的TIL細胞，檢測到遺傳標記細胞在血液和腫瘤組織出現。這一研究證實了反轉錄病毒基因轉移進行人類基因治療的可行性和基本的安全性。首例基因治療

1990年Blease,Culver和Anderson

治療腺苷酸脫氨酶（ADA）缺陷病。

取4歲女孩患者淋巴細胞將ADA基因體外導入激活的T淋巴細胞，再輸回體內，患者免疫功能明顯提高。

20％ADA活性已足夠避免發(fā)病。糾正的少許細胞已可緩解疾病。1、可能進行基因治療的遺傳病

以替代療法為主

腺苷酸脫氨酶缺乏病（ADA）囊性纖維瘤（CF）血友病甲血友病乙地中海貧血血紅蛋白病a抗胰蛋白血癥家族性高膽固醇血癥（FH）高雪?。℅D）I型高血氨病白細胞粘附缺陷?。↙AD）慢性肉芽腫?。–GD）亨特綜合征，進行性肌營養(yǎng)不良。

考慮以下幾個因素：

1）對致病基因有較詳細的了解，能在實驗室克隆出來，并在真核細胞中表達；

2）只須產生較少量的基因產物就能改善癥狀；

3）即使導入基因過量表達，對機體也無不良影響。

基因治療的選擇X連鎖鐵粒幼細胞貧血（XLSA）。XLSA系紅系特異性δ-氨基γ-酮戊二酸合成酶2（ALAS-2）基因突變所致，ALAS-2基因定位于X染色體上。XLSA晚期多并發(fā)嚴重的繼發(fā)性血色病，大量鐵沉積造成成年后糖尿病、肝硬化、心肌變性等致命性并發(fā)癥?；颊哓氀^重，不能采用放血療法。基因治療則有可能成為一種有前途的治療手段。

我們的基因治療探索遺傳性鐵粒幼細胞貧血（老哥倆和小哥倆的故事）

張姓小哥倆鐵粒幼細胞家系的SSCP圖

外祖父外祖母父親母親哥哥弟弟正常臍血基因治療程序患者或者監(jiān)護人知情同意上報審批體外試驗對患者進行含ALAS2基因的質粒表達載體直接骨髓內注射。觀察患者HGB情況四、基因治療的挫折

過度免疫反應，

發(fā)生了急性白血病

首例基因治療的死亡病例

18歲患有先天性酶缺陷的Gelsinger不幸成為第一例基因治療死亡病例（1999年9月17日）。

在賓西法尼亞大學接受以腺病毒為載體的基因治療。通過肝動脈注射了大劑量的病毒載體。

注射后幾小時患者體溫升高達攝氏40.7℃，第二天出現昏迷。透析治療并使用呼吸機，但肺水腫，血氧濃度降低，注射后4天死亡。

主治大夫賓西法尼亞大學Wilson解釋：

給患者注射的病毒載體到達肝細胞不會大于1%。并未達到致死劑量?；颊吖撬杓t系造血極度衰竭，可能合并有其他的遺傳疾病，或者同時伴有微小病毒的感染，二者都會觸發(fā)很強的免疫反應。

德國研究者將與腺病毒具有相同蛋白質外殼的病毒加入18個人類血樣中，觸發(fā)了強烈的補體系統(tǒng)的反應。認為Gelsinger接受的病毒注射劑量將會提高補體濃度并觸發(fā)免疫反應。

患者在基因治療之前曾經有胸部感染，所以補體系統(tǒng)可能已經致敏，病毒的外殼蛋白質可以在血循環(huán)里與抗體結合，形成復合物，激活補體，引起肝臟，肺和腎臟的血管壁的炎性反應，最終導致多器官衰竭。

腺病毒觸發(fā)免疫反應

美國FDA取消了Wilson從事任何臨床實驗的資格。還一度停止了賓西法尼亞大學研究所的所有基因治療臨床實驗，包括對黑色素瘤、乳腺癌、囊性纖維化、肌營養(yǎng)不良、神經膠質瘤的治療。

Gelsinger去世是基因治療臨床研究最大打擊

白血病發(fā)生也在打擊基因治療

法國方案治療的11例患兒里，最初發(fā)現一名患兒的T細胞數顯著增加，而且是單克隆增生。后被確診為T細胞白血病，檢查發(fā)現Moloney逆轉錄病毒載體插入了11號染色體LMO2基因的編碼區(qū)，此基因的產物是血細胞早期發(fā)育所必須的。ChristofVonKalleofCincinnatiChildren'sHospitaldiscoveredthattheretroviralvectorusedintheFrenchtrialhadinsertedintomorethan40sitesinthegenomeofdifferentrepopulatingcells.IntheT-cellclonethatgrewabnormally,thevectorhadinsertedintheLMO-2oncogeneonchromosome11—ageneoriginallyidentifiedasabreakpointofatranslocationthatcausesatypeofT-cellleukemia.Theretrovirusinsertionappearedtohavecausedincreasedexpressionofthegene.

逆轉錄病毒載體導致了白血病

X-SCID治療后的2到6年的時間，法國4名兒童發(fā)生白血病，英國1名兒童出現了T細胞增殖克隆。

發(fā)生白血病的原因是：

MLV的LTR使宿主細胞的原癌基因上調。γ-逆轉錄病毒載體自然的插入活化基因，病毒LTR區(qū)強勁的增強子可使得附近的啟動子引起基因不正常的表達。

基因治療還需要解決下列問題：

不恰當的基因整合，

外源基因引起的免疫反應，

基因載體轉染效率太低，

都困擾著這一領域的發(fā)展。準媽媽懷孕8個月被查出患白血病堅持生下雙胞胎2014年12月01日15:48來源:法制晚報去年年底，26歲的周潔懷孕了，還是雙胞胎，這讓周潔一家欣喜若狂。就在她懷孕8個月時卻被查出患有白血病，這突如其來的消息讓周潔備受打擊。休息一會兒五、慢病毒載體帶來新的希望

以前認為逆轉錄病毒或者腺病毒更安全，這些病毒不感染人類，不會導致人類疾病，最早的病毒改造載體是以鼠源的白血病病毒（MurineLeukaemiaVirusMo-MLV)為基礎。

現在認為，最好使用那些分子生物和病理特性都十分清晰地病毒，最好有可用的藥物治療，可以控制病毒載體可能引起的免疫和炎癥反應。

方芳朱平：慢病毒載體的改進為基因治療帶來了新的希望中國實驗血液學雜志2013,21（5）：1336-1339HIV改造的慢病毒載體(lenteviralvector)

提高安全性，過去2個質粒分裝到4個質粒

1）表達工具和反式序列

2）組裝質粒，編碼形成病毒顆粒的蛋白

3）Rev序列質粒

4）編碼病毒的衣殼蛋白質粒

慢病毒載體的改進慢病毒載體4個質粒一同轉染到T293細胞中，使其大量增殖。最終獲得大量表達質粒。轉染靶細胞時僅使用表達質粒。絕緣體

Nienhuis和Rivella等分別設計了一種絕緣體（insular），位于載體中目的基因的兩側，使得慢病毒載體攜帶的基因插入到指定位置后，也只能表達目的基因，不會因為插入到原癌基因附近導致其激活。

六、應用慢病毒載體臨床試驗

1.慢病毒載體治療HIV感染患者（Levine等）

5名患者之前接受過4到6個不等療程的抗病毒治療失敗。他們使用的載體命名VRX496，它包含HIV的LTR全長，同時表達937堿基的反義基因。通過反義鏈與HIV的RNA結合，抑制HIV的復制。

輸入10*109的轉染T細胞，患者體內持續(xù)存在。4名觀察到針對HIV的細胞免疫。4年隨訪中，沒有發(fā)生白血病或者其他嚴重的與基因治療相關的不良事件。3名患者在之后的2年時間里可以檢測到轉染細胞，部分病人觀察到一過性的病毒負荷減低，都沒有不正常的細胞增殖。

2.慢病毒載體用于地中海貧血和鐮狀細胞貧血

因為患者需要不斷地輸血治療，因此臨床觀察就有必要區(qū)分是轉染基因的表達還是輸血治療效果。因此Bank以及Cavazzana-Calvo等對人類β-球蛋白87位密碼子進行點突變，構建LentiGlobin慢病毒載體。

3名患者加入到這個臨床試驗。其中2名患者基因治療已經5年了。平均每個骨髓CD34+中可以含有0.6個載體，血紅蛋白維持在9~10g/dl,大約1/3來源于Hb-βat87Q,1/3是HbE，1/3是HbF。不用輸血治療，紅系增生一直保持活躍狀態(tài)。3.慢病毒載體用于X連鎖的腎上腺腦白質營養(yǎng)不良

一種致命性的中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘疾病，編碼ALD蛋白的ABCD1發(fā)生基因突變，缺乏ADL蛋白干擾細胞髓磷脂代謝，大多于青少年期死亡。

Cartier等對兩名ALD患者做了慢病毒介導的造血干細胞（HSC）做基因治療。

兩名患者分別為7.5歲和７歲，注射G-CSF后分離外周血CD34+細胞，轉染慢病毒載體（CG1711hALD），清骨髓治療后輸注。

兩例患者的輸入的CD34+細胞中50％和33％表達ALD蛋白。在轉染的５天后蛋白就表現出酶活性。９個月或12個月CT證實這種脫髓鞘損害信號消失。

導入細胞毒T細胞，導入抑癌基因、導入反義核酸、導入HLA/B7共刺激分子、導入自殺基因、導入多藥耐藥基因。4.腫瘤的基因治療類型包括：

七、改造淋巴細胞基因做免疫治療1.淋巴細胞輸注治療的來源獲得淋巴細胞自身，供者（DLI），GVHD抗原刺激淋巴細胞合成多肽，基因疫苗改造淋巴細胞轉T細胞受體基因外周血采集細胞用于免疫治療（邢艷平等LMP2混合肽負載樹突狀細胞與EB病毒感染患者外周血單個核細胞共培養(yǎng)產生識別EB病毒抗原的T細胞

中國實驗血液學雜志

2008，16（2）:392-396）誘導T淋巴細胞和NK細胞

EBV-淋巴瘤中國人多見。迄今沒有很好的治療方法。我們發(fā)現許多母子體細胞存在微嵌合狀態(tài)，給一批確診EBV相關淋巴瘤輸注母親淋巴細胞，一周左右獲得明顯臨床癥狀及病毒學指標的改善，無一例發(fā)生明顯GVHD。

大劑量母親淋巴細胞輸注（NIMA）可作為一種有效治療兒童EB病毒相關淋巴瘤的有效手段。

2.用母親淋巴細胞輸注的“NIMA”

療法BCAAtypicalTlymphocyteinfiltration(Hematoxylin-eosinstain;originalmagnification20×10)ImmunohistochemistrystaindemonstratestumorcellsexpressingCD3(originalmagnification20×10)Insituhybridization:EBER(+)實時定量PCR檢測InDel多態(tài)性位點：

13/46(28%母子對可以檢出)ChildMother

美國血液學年會報告，BLOOD2010發(fā)表。

2.尋找并且人工合成相應的抗原多肽激活淋巴細胞

已經應用的抗原肽包括：

白血病HLA相關肽：BCR/ABL，PML/RARa，NPM1；

次要組織相容抗原肽ACC1HA1；

病毒抗原混合肽：CMV，EBV。

我們在不同B淋巴瘤亞基因家族的IgHV編碼基因上找到了12個高親和力的抗原９肽。用抗原9肽刺激的CTL輸注給接種淋巴瘤的小鼠，CTL可以特異性識別和殺滅表達同樣IgHV亞家族淋巴瘤。

（LiuH,CaiP,LiuHX,WangJL,LiuQ,ZhuP.Vaccinationwithimmunoglobulinframeregion-derivednonapeptideelicitscellularimmuneresponseagainstlymphomainhumanleukocyteantigen-A2.1transgenicmice.LeukLymphoma.2011Sep;52(9):1795-802.）

用這些抗原9肽刺激獲得的CTL輸注給接種淋巴瘤的小鼠，CTL可以特異性識別和殺滅表達同樣IgHV亞家族淋巴瘤。

鼠脾臟細胞Elispot結果

實驗組PBS+BSA組PBS組（LiuHui

etal.LeukLymphoma.2011Sep;52(9):1795-802.）

Pentamertest判斷特異性淋巴細胞的數量

確定抗腫瘤淋巴細胞克隆，

用基因掃描方式分析了T細胞克隆的TCR特征，

克隆TCR片段，

組裝完整的TCR在淋巴細胞表面表達，

大量擴增改造的淋巴細胞

輸注給患者。

3.轉TCR基因改造淋巴細胞做免疫治療TCR轉基因改造方法：T細胞受體基因掃描（genescan)和T細胞受體基因譜型圖（Spectrotyping)抗TCRBV的單克隆抗體分離淋巴細胞（FACS）HLA/epitope/Pentamer(tetramer)T細胞γ-干擾素分泌水平（ELISpot）T細胞殺傷功能（FATAL）FR1CDR1FR3FR2CDR3CDR2DJC正常人T細胞受體β鏈可變區(qū)(TCRBV)

24家族克隆分布

TCRBV24基因家族流式細胞分析TCR24家族流式細胞術尋找殺傷細胞克隆確定單克隆T淋巴細胞

我們獲得一個白血病病例T細胞優(yōu)勢克隆的

1條關鍵的TCRBV序列和3條TCRAV序列

患者優(yōu)勢T細胞克隆為TCRBV13.1

優(yōu)勢T細胞克隆得到TCRA1,TCRA10和TCRA243個序列,轉染淋巴細胞后組成了改造淋巴細胞表面的TCRαβ2聚體。

TCRAV1家族測序圖TCRAV10家族測序圖TCRAV24家族測序圖

將患者疾病相關T細胞克隆的TCRαβ序列克隆到基因載體。用電轉移法轉染正常T細胞和Jurkat細胞,培養(yǎng)并擴增。獲得能夠識別腫瘤特異性抗原肽的轉基因CTL細胞。

轉TCR基因淋巴細胞轉T細胞受體基因改造的一例

移植后白血病體內供者的淋巴細胞

（XingHai-zhouetal.Clin.Lab.2014;60）Clin.Lab.2014;60ORIGINALARTICLE

DonorLymphocytesmayAcquireCytolyticSpecificitytoDonor’sEngraftedHematopoieticCellsafteraHemato