化妝品中克雷伯氏菌的檢測(cè)方法

出口果蔬汁中環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌檢測(cè)方法計(jì)劃編號(hào)：2009B136編制說(shuō)明項(xiàng)目承擔(dān)單位：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院項(xiàng)目負(fù)責(zé)人：趙貴明項(xiàng)目起止時(shí)間：2010.1-2010.10二0—0年十月《出口果蔬汁中環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌檢測(cè)方法》

編制說(shuō)明一、 工作情況和任務(wù)來(lái)源任務(wù)來(lái)源本部分為國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫部門下達(dá)的2010年度制標(biāo)任務(wù)計(jì)劃，計(jì)劃編號(hào)為2009B136。標(biāo)準(zhǔn)制訂的工作過(guò)程①標(biāo)準(zhǔn)的申報(bào)；②資料查詢整理；③制定工作計(jì)劃；④標(biāo)準(zhǔn)方法的驗(yàn)證；⑤按照GB/T1.1-2000進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)和編制說(shuō)明的起草并送專家征求意見(jiàn)；⑥總結(jié)反饋信息和意見(jiàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行改進(jìn)；⑦整理資料申報(bào)有關(guān)部門審定。完成單位：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局、陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局、吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院、北京奧博星生物技術(shù)有限公司。標(biāo)準(zhǔn)起草人：本標(biāo)準(zhǔn)第1部分主要起草人：趙貴明張琦王小玉趙勇勝史艷宇楊海榮胡玥馮家望葛秋惠。本標(biāo)準(zhǔn)第2部分主要起草人：史艷宇趙貴明邴煒王娉華蕾二、 編制本標(biāo)準(zhǔn)的目的和意義近幾年，我國(guó)果蔬汁出口貿(mào)易穩(wěn)步上升，2006-2007榨季，中國(guó)濃縮蘋果汁出口量就達(dá)到104萬(wàn)噸，占到國(guó)際市場(chǎng)貿(mào)易總量的67%，成為我國(guó)食品工業(yè)中發(fā)展最快的行業(yè)之一，預(yù)計(jì)到2010年用于果汁加工的水果總量將達(dá)到2482萬(wàn)噸，而腐敗微生物是既農(nóng)殘之后成為影響果蔬汁產(chǎn)品質(zhì)量及國(guó)際貿(mào)易的主要因素。在果蔬汁生產(chǎn)過(guò)程中，從原料到產(chǎn)品要經(jīng)過(guò)選果清洗-壓榨-酶解-超濾-脫色-濃縮(殺菌)環(huán)節(jié)，由于原料、環(huán)境、空氣中存在環(huán)脂芽孢桿菌及其芽孢，不可避免將芽孢帶入成品中，即使在酸性條件下經(jīng)過(guò)巴氏殺菌仍不能將其滅活，產(chǎn)品放置一段時(shí)間后，芽孢萌發(fā)，在代謝過(guò)程中產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚和2,6-二漠苯酚，有類似“草藥味”或“防腐劑”的不爽味道，1x10-12的含量就能造成果汁風(fēng)味敗壞并產(chǎn)生輕微沉淀。為此，從1999年，美國(guó)等進(jìn)口國(guó)要求濃縮果汁中嗜酸耐熱菌小于1個(gè)/10ml(g)；2001年歐洲大部分果汁消費(fèi)國(guó)也提出相同指標(biāo)要求，而到2002年后，對(duì)50ml濃縮果汁中嗜酸耐熱菌不得檢出幾乎成為常規(guī)指標(biāo)，目前陽(yáng)性樣品的比例約為2%，其比例已高于其他食品中的病原微生物。導(dǎo)致果蔬汁腐敗的微生物，細(xì)胞膜含有共同的3-環(huán)狀脂肪酸，1992年Wisotzkey等人根據(jù)16SrDNA基因序列分析結(jié)果，將它們從芽孢桿菌屬(Bacillus)中劃分出來(lái)，成立一新屬，命名為環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)，簡(jiǎn)稱為環(huán)脂芽孢桿菌，該屬菌目前包括8個(gè)種、2個(gè)亞種。由于目前企業(yè)缺乏快速、有效的檢測(cè)和監(jiān)控手段，使得產(chǎn)品流通到消費(fèi)者手中腐敗才會(huì)被發(fā)現(xiàn)，成為濃縮果汁生產(chǎn)廠家最為棘手的問(wèn)題。目前已有果汁中檢測(cè)環(huán)脂酸芽孢桿菌的方法，如日本果汁協(xié)會(huì)耐酸耐熱菌統(tǒng)一檢測(cè)方法、美國(guó)庫(kù)克實(shí)驗(yàn)室耐熱耐酸菌的檢測(cè)方法、日本NDM公司耐熱耐酸菌的檢測(cè)方法、美國(guó)雀巢公司耐熱耐酸菌檢測(cè)方法等，但國(guó)內(nèi)外沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)方法，不同實(shí)驗(yàn)室采用不同檢測(cè)方法，常使檢測(cè)結(jié)果存在差異，直接影響了我國(guó)果蔬汁的出口貿(mào)易。因此，制訂檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，將大力推進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，保障我國(guó)果蔬汁出口貿(mào)易順利進(jìn)行。三、 標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)共分為二個(gè)部分，第1部分“分離與計(jì)數(shù)方法”的內(nèi)容參照國(guó)際果汁生產(chǎn)商聯(lián)合會(huì)(InternationalFederationofFruitJuiceProducters,IFU)頒布的“導(dǎo)致果汁變質(zhì)的果汁中環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌檢測(cè)方法”(MethodontheDetectionofTaintProducingAlicyclobacillusinFruitJuice)2007版進(jìn)行實(shí)踐研究，并通過(guò)試驗(yàn)和驗(yàn)證后制訂。第2部分“熒光PCR方法”為快速篩選方法，參考文獻(xiàn)“Developmentofareal-timePCR-basedsystemtargetingthe16SrRNAgenesequenceforrapiddetectionofAlicyclobacillusspp.injuiceproducts”(InternationalJournalofFoodMicrobiology99(2005)229-235)，并通過(guò)試驗(yàn)和驗(yàn)證后制訂。第1部分分離與計(jì)數(shù)方法本部分采用的樣品處理方法、增菌方法、分離培養(yǎng)基及可疑菌落鑒定方法研究如下：1材料1.1培養(yǎng)基及試劑1.1.1皿脂TOC\o"1-5"\h\z成分：酵母提取物 2.5g蛋白胨 5.0g葡萄糖 1.0g吐溫80 1.0g瓊脂 15.0g制法：將上述成分混合，加入11去離子水。121。。高壓滅菌15min。冷卻至50°C,用25%蘋果酸調(diào)節(jié)pH值至3.7。YSG瓊脂及YSG肉湯TOC\o"1-5"\h\z成分：酵母提取物 2.0g葡萄糖 1.0g可溶性淀粉 2.0g瓊脂 15.0g制法：將上述成分混合，加入11去離子水。121C高壓滅菌15min。冷卻至50C，用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.7。YSG肉湯：成分同YSG瓊脂培養(yǎng)基，但不包括瓊脂。調(diào)節(jié)pH值后再121C高壓滅菌15min。BAT瓊脂及BAT肉^成分：CaCl2.2H2O 0.25gMgSO4.7H2O 0.50g(NH4)2SO4 0.20gTOC\o"1-5"\h\zKH2PO4 3.0g酵母提取物 2.0g葡萄糖 5.0g痕量礦物質(zhì)溶液 1.0mL去離子水 500mL用1NH2SO4或者1NNaOH調(diào)節(jié)pH值至4.0。121C高壓滅菌15min后冷卻至50C。痕量礦物質(zhì)溶液：TOC\o"1-5"\h\zA) CaCl2.2H2O 0.66 gZnSO4.7H2。 5 gCuSO4.5H2O 0.16 gMnSO4.H2O 0.15 gCOCl2.6H2O 0.18 gH3BO3 0.10 gNaMoO4.2H2O 0.30g去離子水 1000mL高壓滅菌后于冰箱中保存。B)瓊脂 15g?20g去離子水 500mL121°C高壓滅菌15min后冷卻至50°C。無(wú)菌等體積混合A.4.1和A.4.2,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH值至4.0,倒平板。BAT肉湯：成分同BAT瓊脂培養(yǎng)基，但不包括瓊脂。調(diào)節(jié)pH值后再121C高壓滅菌15min。1.1.4香草酸：100mg/kgo1.2試驗(yàn)菌株環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌：AlicyclobacillusacidocaldariusATCC43030,AlicyclobacillusacidocaldariusATCC43031,AlicyclobacillusacidocaldariusATCC43033,AlicyclobacillusacidoterrestrisATCC49025,AlicyclobacillusacidoterrestrisATCC49027,AlicyclobacilluscycloheptanicusATCC49029,Alicyclobacillusacidocaldariussubsp.AcidocaldariusATCC27009,AlicyclobacillussendaiensisATCCBAA-609,Alicyclobacillussp.ATCCBAA-757,AlicyclobacillusvulcanalisATCCBAA-915，均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。菌種按照ATCC提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件復(fù)蘇后分別接種ATCC要求的培養(yǎng)基培養(yǎng)后備用。其他參考菌株：枯草芽孢桿菌IQCC22734；蠟樣芽孢桿菌IQCC22735,地衣芽孢桿菌IQCC22736,來(lái)自中國(guó)中國(guó)檢科院食品安全研究所菌種保藏中心。1.3實(shí)驗(yàn)樣品樣品基質(zhì)為濃縮蘋果汁，樣品來(lái)源于陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局微生物實(shí)驗(yàn)室保存樣品。本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)樣品，6份。原始標(biāo)號(hào)分別為經(jīng)采用本標(biāo)準(zhǔn)制定的出口果蔬汁中環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌檢測(cè)方法檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。表1果汁樣品編號(hào)實(shí)驗(yàn)編號(hào)原始編號(hào)原產(chǎn)地1070104-5245山西2070113-7137山西3070121-5263山西4061017-10395陜西52807075-61101陜西62807077-61103陜西2.方法與結(jié)果2.1增菌培養(yǎng)環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌43030、43031、43033、49025、49027、49029、27009、BAA-609、BAA-757、BAA-915以及枯草芽孢桿菌；蠟樣芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌的菌液1ml,分別接種于10mlBAT肉湯和YSG肉湯，置培養(yǎng)箱45C±1C培養(yǎng)2d,觀察試驗(yàn)菌株其在不同肉湯中的生長(zhǎng)情況(見(jiàn)表2),經(jīng)觀察環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌在BAT肉湯和YSG肉湯中生長(zhǎng)差異不大，但其他芽孢桿菌不生長(zhǎng)。

表2.實(shí)驗(yàn)菌株在不同肉湯中的生長(zhǎng)情況***_培養(yǎng)液菌種號(hào)*一_BAT增菌液YSG增菌液43030++++++43031++++++43033++++++49025++++++++49027++++++++49029++++++27009++++++BAA-609++++++BAA-757++++++BAA-915++++++22734--22735--22736--2?2.分離培養(yǎng)環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌43030、43031、43033、49025、49027、49029、27009、BAA-609、BAA-757、BAA-915以及枯草芽孢桿菌；蠟樣芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌7316的菌液，各取一環(huán)，四區(qū)法劃線接種于BAT、YSG和K瓊脂平板，45°C±1°C培養(yǎng)48h-32h,觀察實(shí)驗(yàn)菌株在上述平板上的生長(zhǎng)情況，見(jiàn)表3。表3實(shí)驗(yàn)菌株在不同平板上的生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)\平板菌株K瓊脂YSG瓊脂BAT瓊脂生長(zhǎng)形態(tài)生長(zhǎng)形態(tài)生長(zhǎng)形態(tài)43030-—++菌落扁平，邊緣不規(guī)則，無(wú)色+++菌落扁平，邊緣不規(guī)則，無(wú)色43031-—++菌落扁平，邊緣不規(guī)則，無(wú)色+++菌落扁平，邊緣不規(guī)則，無(wú)色43033-—++菌落扁平，邊緣不規(guī)則，無(wú)色+++菌落扁平，邊緣不規(guī)則，無(wú)色49025++++菌落圓形，較大，白色，不誘明++++菌落圓形，較大，黃白色，不誘明++++菌落圓形，較大，黃白色，不誘明49027++++菌落圓形，較大，白色，不誘明++++菌落圓形，較大，黃白色，不誘明++++菌落圓形，較大，黃白色，不誘明49029-—++菌落圓形，較小，黃白色，不誘明+++菌落圓形，較小，黃白色，不誘明27009-—++菌落圓形，較小，黃白色，不誘明+++菌落圓形，較小，黃白色，不誘明BAA-609-—++菌落圓形，微黃色，濕潤(rùn)中心凸起+++菌落圓形，微黃色，濕潤(rùn)中心凸起

BAA-757-—++菌落圓形，微黃色，濕潤(rùn)中心凸起+++菌落圓形，微黃色，濕潤(rùn)中心凸起B(yǎng)AA-915-—++菌落圓形，微黃色，濕潤(rùn)中心凸起+++菌落圓形，微黃色，濕潤(rùn)中心凸起22734-—-—-—22735-—-—-—22736-—-—-—注：“+”為生長(zhǎng)情況，“-”為不生長(zhǎng)。圖1ATCC43030在YSG培養(yǎng)基上的菌落特征(菌落圓形，黃白色，不透明或半透明)2.3顯微鏡檢和芽抱染色從K瓊脂平板平板上挑取45°C±1°C培養(yǎng)48h的ATCC43030和ATCC49025菌落，作涂片、干燥、固定；滴加3—5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上；用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時(shí)可添加少許染液。加熱時(shí)間從染液冒蒸汽時(shí)開(kāi)始計(jì)算約4—5分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液(約7.6%)染10分鐘。傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗至水為無(wú)色。待干燥后，置油鏡觀察，芽泡呈綠色，菌體呈紅色。圖2ATCC43030的染色圖片(菌體為紅色，芽抱呈綠色)2.4樣品檢測(cè)步驟(1)樣品的稀釋使用適當(dāng)?shù)臏邕^(guò)菌的工具和容器無(wú)菌采集具有代表性的樣品，平行稱取310g樣品，其中2份樣品用蒸餾水進(jìn)行1：10稀釋，其余1份樣品用YSG肉湯進(jìn)行1：10稀釋，混勻。熱處理將樣品稀釋液置于80°C±1°C恒溫水浴鍋中，水面高度須超過(guò)樣品高度，使樣品稀釋液溫度5min內(nèi)上升至79C?80C，加熱10min。取出樣品稀釋液，冷卻至40C?45C，可用含冰的涼水進(jìn)行冷卻。濾膜法計(jì)數(shù)將2個(gè)100mL熱處理過(guò)的樣品稀釋液，用直徑0.45m的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，用20mL清洗液(如無(wú)菌去離子水)沖洗濾膜后，無(wú)菌取出濾膜，將第一個(gè)膜置于K瓊脂上，另一個(gè)膜置于YSG瓊脂上，避免氣泡產(chǎn)生。與此同時(shí)，將對(duì)照菌株A.acidoterrestrisATCC45025和A.acidocaldariusATCC43030在相同平板上劃線。直接涂布平板(直接計(jì)數(shù))取0.1mL熱處理樣品接種于K瓊脂和YSG瓊脂或BAT瓊脂上。與此同時(shí)，將對(duì)照菌株A.acidoterrestris和A.acidocaldarius在相同平板上劃線。平板培養(yǎng)將所有平板和增菌肉湯于45C±1C培養(yǎng)2d?5d，觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中可以將平板置于密封袋或其他密封容器中來(lái)避免培養(yǎng)基干燥。增菌法定性檢測(cè)將100mL加熱處理的樣品于45C±1C進(jìn)行增菌培養(yǎng)。增菌肉湯的傳代培養(yǎng)增菌培養(yǎng)2d后，輕混增菌肉湯，取一菌環(huán)菌液接種于K瓊脂和YSG瓊脂和BAT瓊脂上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，如果(至少培養(yǎng)2d)無(wú)典型的環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌菌落生長(zhǎng)，將肉湯增菌5d后，再進(jìn)行傳代接種。傳代培養(yǎng)的同時(shí)，將標(biāo)準(zhǔn)菌株A.acidoterrestrisATCC49025和A.acidocaldariusATCC43030進(jìn)行劃線培養(yǎng)?？梢删_證試驗(yàn)檢查K瓊脂，YSG和BAT瓊脂上的菌落，選擇每種菌落形態(tài)的2個(gè)菌進(jìn)行確證試驗(yàn)。從每個(gè)挑選的菌落一部分劃線接種于一塊K瓊脂平板、一塊中性pH培養(yǎng)基平板(如：菌落計(jì)數(shù)平板、TSA或腦心浸液瓊脂)和兩個(gè)YSG瓊脂平板，將其中1個(gè)YSG瓊脂平板在65C±1C培養(yǎng)2d?3d，其余各平板在45C±1C培養(yǎng)3d?5d。YSG和BAT能夠支持目前已知的環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌屬中各個(gè)種的細(xì)菌生長(zhǎng)，與K瓊脂相比，更寬泛的環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌會(huì)在兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出可見(jiàn)菌落。2.5實(shí)驗(yàn)樣品及人工添加實(shí)驗(yàn)樣品檢測(cè)結(jié)果6份樣品經(jīng)本方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。選取1-4號(hào)樣品進(jìn)行人工添加實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4表4人工添加樣品檢測(cè)結(jié)果樣品編號(hào)與檢測(cè)方法K瓊脂YSG瓊脂BAT瓊脂

450C650CpH4pH71濾膜法-+-涂布法-+-+-增菌法-+-+-2濾膜法++-+-涂布法++-+-增菌法++-+-3濾膜法++-+-涂布法++-+-增菌法++-+-4濾膜法-----涂布法-----增菌法-----注："+”為生長(zhǎng)情況，“-”為不生長(zhǎng)。1號(hào)樣品添加ATCC43030；2號(hào)樣品添加ATCC49025；3號(hào)樣品添加ATCC49027；添加量為10-100cfu/ml。4號(hào)樣品未添加。3結(jié)論和說(shuō)明3.1檢測(cè)原理說(shuō)明（1）環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌通常以較低數(shù)量存在于果蔬汁中，因此選擇靈敏度較高的濾膜法和增菌方法十分必要。濾膜法和直接涂布法可定性和定量檢測(cè)果蔬汁中環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌，但二者檢測(cè)低限不同，分別為1pfu/10g和1pfu/0.01g。增菌法為定性檢測(cè)方法。（2） 實(shí)驗(yàn)中的熱休克處理十分必要，由于環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌通常以芽孢形式存在于產(chǎn)品和成分中，熱處理可以刺激芽孢的萌發(fā)和生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)果蔬汁中可能存在的其他菌進(jìn)行滅活。（3） 鑒于環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌的生物特性，培養(yǎng)基中的酸化環(huán)境是必要的，YSG和BAT培養(yǎng)基支持目前已知的所有環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)， K瓊脂支持多數(shù)情況下引起果蔬汁腐敗的A.acidoterrestris的生長(zhǎng)，而限制該屬其他菌如A.acidocaldarius的生長(zhǎng)，因此，K瓊脂主要用于檢測(cè)A.acidoterrestris。（4） 有必要對(duì)疑似環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌進(jìn)行確證試驗(yàn)，可通過(guò)在pH<3.8的培養(yǎng)基上產(chǎn)生芽孢而在中性培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)得到驗(yàn)證。（5） 目前已知產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚的環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌其過(guò)氧化物酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，而且這些菌的生長(zhǎng)溫度低于65oC。3.2方法中所用各平板的特點(diǎn)與主要用途表4環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌在三種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特點(diǎn)與用途-一__優(yōu)缺點(diǎn)詵擇性平板---------一一特點(diǎn)用途K瓊脂支持引起果蔬汁腐敗的主要環(huán)狀脂肪酸芽抱桿菌A.acidoterrestris的生長(zhǎng)，對(duì)該屬其他菌則限制生長(zhǎng)主要用于產(chǎn)生腐敗氣味的A.acidoterrestris的分離；鏡檢與芽抱染色檢測(cè)YSG瓊脂適合所用環(huán)狀脂肪酸芽抱桿菌的生長(zhǎng)環(huán)狀脂肪酸芽抱桿菌的增菌與分離培養(yǎng)；65°C驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)BAT瓊脂酸性生長(zhǎng)環(huán)境下適合所有環(huán)狀脂肪酸芽抱桿菌的生長(zhǎng)，中性環(huán)境下適合所有芽孢桿菌的生長(zhǎng)pH值適應(yīng)性驗(yàn)證試驗(yàn)，環(huán)狀脂肪酸芽抱桿菌在pH<3.8時(shí)生長(zhǎng)，pH>6時(shí)則不生長(zhǎng)四、標(biāo)準(zhǔn)的使用情況及驗(yàn)證本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)福建出入境檢驗(yàn)檢疫局、廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局、廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局、山西出入境檢驗(yàn)檢疫局和吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局五家單位驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)論：本標(biāo)準(zhǔn)所建立的方法是技術(shù)路線合理，靈敏度及特異性高，可用于出口果蔬汁中環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌的檢驗(yàn)。五、主要參考資料MethodontheDetectionofTaintProducingAlicyclobacillusinFruitJuice.InternationalFederationofFruitJuiceProducters.IFUMB12，2007.IsabelWalls,RolendaChlyate.IsolationofAlicyclobacillusacidoterrestrisfromFruitJuice.AOACInternational.2000,(83)5:1115-1120.WitthuhnRC,DuvenageW,GouwsPA.EvaluationofdifferentgrowthmediafortherecoveryofthespeciesofAlicyclobacillus.LettApplMicrobiol.2007,45(2):224-229.第2部分熒光PCR方法1.檢測(cè)對(duì)象及測(cè)試樣品種類1.1環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌陽(yáng)性菌株Alicyclobacillspp.(1)A.acidocaldarius(ATCC43030)；(2)A.acidoterrestris(ATCC49025)。1.2特異性驗(yàn)證所需菌株(1)BacillussubtilisOSU494，枯草芽孢桿菌；(2)EscherichiacoliDH-5a,大腸桿菌；(3)GeobacillusstearothermophilusATCC10149，嗜熱脂肪地芽孢桿菌；(4)LactobacillusplantarumATCC8014，植物乳桿菌；(5)LeuconostocmensenteroidsATCC15935；(6)Lactococcuslactissubsp.LM2301，乳酸乳球菌；(7)PseudomonasputidaATCC49451，惡臭假單胞菌。以上各菌株均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。1.3培養(yǎng)基1.3.1K液體培養(yǎng)基成分蛋白胨5.0g酵母提取物2.5g葡萄糖1.0g吐溫-801.0g蒸餾水1000.0mL制法將各成分加入蒸餾水中溶解，用25%蘋果酸調(diào)pH值至4.0±0.2。121^高壓滅菌15min。1.3.2其他培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯；LB肉湯；MRS肉湯；M17-G肉湯；胰蛋白胨大豆肉湯等均購(gòu)自于北京陸橋有限公司。2.檢測(cè)方法研究2.1增菌Alicyclobacillusacidoterrstri，ATCC49025，Alicyclobacillusacidocal-darius，ATCC43030于402培養(yǎng)液中47°C培養(yǎng)24h~48h；BacillussubtilisOSU494于營(yíng)養(yǎng)肉湯中37°C培養(yǎng)24h；Escherichiacoli于LB肉湯中37C培養(yǎng)24h；GeobacillusstearothermophilusATCC10149于營(yíng)養(yǎng)肉湯中55C培養(yǎng)24h；LactobacillusplantarumATCC8014和LeuconostocmensenteroidsATCC15935均在MRS肉湯中37C培養(yǎng)24h；LactococcuslactissubspLM2301在M17-G肉湯中30C培養(yǎng)24hPseudomonasputidaATCC49451于胰蛋白胨大豆肉湯中30C培養(yǎng)24h。2.2DNA的提取分別取增菌液1mL加到1.5mL無(wú)菌離心管中，8000r/min離心5min，盡量吸棄上清液；加入50以LDNA提取液(使用前室溫解凍并充分混勻，快速吸取)，混合后沸水浴5min，12000r/min離心5min，取上清液以待檢測(cè)(如不能及時(shí)檢驗(yàn)，可將上清液于-20C保存：。也可按細(xì)菌基因組試劑盒進(jìn)行DNA提取。2.3熒光PCR引物設(shè)計(jì)和篩選根據(jù)環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌屬16SrRNA基因在Genebank中檢索到AlicyclobacillusstrainsATCC43030(AY573796)，49025(AY573797)和49029(AY573798)，A.acidoterrestrisstrainDSM3923(AB042058)，A.cycloheptanicusstrainDSM4006(AB042059)，A.acidocaldariusstrainDSM454(AB059664)等6個(gè)環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌基因序列。用Lasergene軟件中的MegAlign對(duì)6個(gè)基因序列進(jìn)行序列同源性比較分析，根據(jù)基因序列中同源性較高部分用PrimerExpress3.0設(shè)計(jì)探針及引物。在Genebank(http:///BLAST)中，經(jīng)Blast軟件對(duì)相似序列搜索后，篩選出一套最優(yōu)與食品中常見(jiàn)細(xì)菌及親源關(guān)系較近的其他屬細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)的引物°Forwordprimer：F1：

5’-CGTAGTTCGGATTGCAGGC-3’；Reverseprimer:5’-GTGTTGCCGACTCTCGTG-3’；Probe:5’-FAM-CGGAATTGCTAGTAATCGC-TEMRA-’。CGTAGTTCGGATTGCAGGCCGTAGTTCGGATTGCAGGCCGTAGTTCGGATTGCAGGCCGTAGTTCGGATTGCAGGCCGTAGTTCGGATTGCAGGCCGTAGTTCGGATTGCAGGCCGTAGTTCGGATTGCAGGCCGTAGTTCGGATTGCAGGCCGTAGTTCGGATTGCAGGC123456789012345678901234567890111CCCAGTTCGGATTGAGGGCTGCAACTCGCCCCCATGAAGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGTAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATTGCTAGTAATCGCCGGAATTGCTAGTAATCGCCGGAATTGCTAGTAATCGCCGGAATTGCTAGTAATCGCCGGAATTGCTAGTAATCGCCGGAATTGCTAGTAATCGCCGGAATTGCTAGTAATCGCCGGAATTGCTAGTAATCGCTGGAGTTGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATGCGTTCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATCCGTTCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTCGGCAACACCACGAGAGTCGGCAACACCACGAGAGTCGGCAACACCACGAGAGTCGGCAACACCACGAGAGTCGGCAACACCACGAGAGTCGGCAACACCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGAAGTCGGAAGCACCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGCTTGCAACACCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTCGACAACACCCGGGCCTTGTAC圖1環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌特異片段擴(kuò)增序列CACGAGAGTCGGCAACACCACGAGAGTCGGCAACACCACGAGAGTCGGCAACACCACGAGAGTCGGCAACACCACGAGAGTCGGCAACACCACGAGAGTCGGCAACACFig.1.Alignmentofthe134-bpregionincludingtheCC16Sprimersandprobe(framed).The16SrDNAsequencesusedinthealignmentwerefrom:(1)A.acidocaldariusATCC43030,(2)A.acidocaldariusDSM454,(3)A.cycloheptanicusATCC49029,(4)A.cycloheptanicusDSM4006,(5)A.acidoterrestrisATCC49025,(6)A.acidoterrestrisDSM3923,(7)C.elmenteitiiisolateE2SE1-B,(8)G.subterraneusK,S.disulfidooxidansSD-11,and(10)B.thermoleovoransATCC43513.(口中內(nèi)容為引物及探針?biāo)诓课?2.4定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系建立及反應(yīng)條件選擇2.4.1反應(yīng)體系的設(shè)置表1每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制表試劑用量PCR反應(yīng)液2.5pLTaq酶(5U/pL)0.5pLDNA模板2pL正義引物(10pmol/L)1.0pL反義引物（10gmol/L）1.0pLProbe(10gmol/L)1.0pLdNTP(10mmol/L)1pL水16pL總體積25pL2.4.2熒光PCR檢測(cè)時(shí)循環(huán)程序設(shè)置37°C：5min（未加UNG酶此步不需要）；95°C：3min；95°C：30sec,55°C:40sec,40個(gè)循環(huán)（55°C收集熒光信號(hào)）2.5引物與探針特異性分析為保證PCR擴(kuò)增結(jié)果特異性，檢測(cè)過(guò)程中設(shè)環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株陽(yáng)性對(duì)照（ATCC49025,ATCC43030）、陰性對(duì)照，同時(shí)對(duì)其他親源關(guān)系較近的相關(guān)菌株：BacillussubtilisOSU494,枯草芽孢桿菌；EscherichiacoliDH-5a，大腸桿菌；GeobacillusstearothermophilusATCC10149,嗜熱脂肪地芽孢桿菌；LactobacillusplantarumATCC8014,植物乳桿菌；LeuconostocmensenteroidsATCC15935；Lactococcuslactissubsp.LM2301，乳酸乳球菌；PseudomonasputidaATCC49451,惡臭假單胞菌等進(jìn)行PCR擴(kuò)增。定量PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，陰性對(duì)照及其他菌株均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，說(shuō)明熒光定量PCR特異性好。（如圖1所示）圖2.特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2Specificitydetectionoftheprobeandprimers2.6檢驗(yàn)方法靈敏度試驗(yàn)利用核酸蛋白分析儀對(duì)脂肪酸芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC49025）DNA進(jìn)行含量測(cè)定后，對(duì)DNA進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別做DNA模板進(jìn)行Real-timePCR擴(kuò)增。分析結(jié)果顯示，2.78x10T2gg/ml的DNA能夠被檢出，而其他更低的稀釋度沒(méi)有信號(hào)增長(zhǎng)，不能被檢出。（如圖3所示）

DeltaRnvsCycleCycleNumberDeltaRnvsCycleCycleNumber圖3以環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌不同稀釋度做的靈敏度結(jié)果從左至右依次為：1，2.78x10-6；2,2.78x10-7；3,2.78x10-8；4,2.78x10-9；5,2.78x10-1。；6,

2.78x10-11；7,2.78x10-12（單位:以g/mlFig.3Sensitivitydetectionoftheprobeandprimers2.7人工污染食品樣品的檢測(cè)4份無(wú)菌果汁樣品（分別為蘋果汁、橘子汁、檸檬汁、桃汁），每份10mL,分別接入適量環(huán)狀脂肪酸芽孢桿菌，然后分別轉(zhuǎn)接到90mL的K液體培養(yǎng)基中，47°C,150rpm增菌培養(yǎng)24h后，從每份樣品中取1mL增菌液，提取。NA,用優(yōu)化的熒光PCR體系進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，陽(yáng)性檢出率為100%,具體結(jié)果見(jiàn)圖4。3.200CycleNumber-0.400 -1 23456789101112131415