MTT法繪制生長曲線

MTT法繪制生長曲線一細(xì)胞生長曲線：A、 目的：學(xué)習(xí)細(xì)胞生長曲線的測定方法，觀察細(xì)胞生長基本規(guī)律。B、 背景知識(shí)細(xì)胞生長曲線是觀察細(xì)胞生長基本規(guī)律的重要方法。只有具備自身穩(wěn)定生長特性的細(xì)胞才適合在觀察細(xì)胞生長變化的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。因而在細(xì)胞系細(xì)胞和非建系細(xì)胞生長特性觀察中，生長曲線的測定是最為基本的指標(biāo)。原理（選填項(xiàng)目）：細(xì)胞生長曲線的測定一般可利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行。C、 材料（一）儀器凈化工作臺(tái)離心機(jī)恒溫水浴箱冰箱（4°C、-20°C）倒置相差顯微鏡培養(yǎng)箱（37°C、5%C02、飽和濕度）（二）玻璃器皿吸管（彎頭）培養(yǎng)瓶玻璃瓶（250ml、100ml）廢液缸（三） 塑料器皿吸頭槍頭24培養(yǎng)板膠塞（四） 其他物品微量加樣槍紅血球計(jì)數(shù)板（五）試劑D-Hanks液小牛血清RPMI1640雙抗（青霉素、鏈霉素）0.08%胰酶（四）、操作步驟取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，采用一般傳代方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液；計(jì)數(shù)，精確地將細(xì)胞分別接種于21?30個(gè)大小一致的培養(yǎng)瓶內(nèi)或培養(yǎng)孔（以24孔培養(yǎng)板為宜），每瓶或孔細(xì)胞總數(shù)要求一致，加入培養(yǎng)液的量也要一致。每天或每隔一天取出3瓶（孔）細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值。培養(yǎng)3?5d常要給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸（對(duì)數(shù)），描繪在半對(duì)數(shù)座標(biāo)紙上，連接成曲線后即成該細(xì)胞的生長曲線。9（五）、注意事項(xiàng)細(xì)胞生長曲線雖然最為常用，但有時(shí)其反映數(shù)值不夠精確，可有20?30%的誤差，需結(jié)合其它指標(biāo)進(jìn)行分析?，F(xiàn)在很多實(shí)驗(yàn)室利用培養(yǎng)板采用MTT法進(jìn)行生長曲線測定，較為簡便。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長曲線近似“S”形，一般在傳代后第一天細(xì)胞數(shù)有所減少，再經(jīng)過幾天的潛伏適應(yīng)期，然后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，達(dá)到平臺(tái)期后生長穩(wěn)定，最后到達(dá)衰老。在生長曲線上細(xì)胞數(shù)量增加1倍時(shí)間稱為細(xì)胞倍增時(shí)間，可以從曲線上換算出。二、四唑鹽試驗(yàn)（MTT）比色試驗(yàn)（一） 、目的學(xué)習(xí)四唑鹽比色試驗(yàn)，檢測細(xì)胞存活和生長情況。（二） 、原理和背景。四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，簡稱MTT?；罴?xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。（三）、材料A、 儀器凈化工作臺(tái)離心機(jī)恒溫水浴箱冰箱（4°C）倒置相差顯微鏡CO2培養(yǎng)箱振蕩混合儀酶聯(lián)免疫檢測儀移液槍電磁力攪拌機(jī)微孔濾器B、 玻璃器皿吸管小燒杯（100ml）廢液缸C、 塑料器皿吸頭槍頭96孔培養(yǎng)板15ml離心管50ml離心管膠塞D、其他物品微量加樣槍紅血球計(jì)數(shù)板F、試劑D-Hanks液小牛血清RPMI1640雙抗（青霉素、鏈霉素）0.08%胰酶二甲基亞砜（DMSO）MTT溶液：稱取250mgMTT，放入小燒杯中，加50ml培養(yǎng)液或平衡鹽溶液在電磁力攪拌機(jī)上攪拌30min,用0.22um的微孔濾器除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆茫瑑芍軆?nèi)有效。（四）、操作步驟接種細(xì)胞：用0.08%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103?104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul。培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37C、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。（培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅┏噬好靠准尤隡TT溶液（5mg/ml）20ul，37C孵箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。對(duì)于懸浮生長的細(xì)胞，需離心（1000rpm,5min），然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150ulDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為終軸繪制細(xì)胞生長曲線。（五）、注意事項(xiàng)選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，對(duì)每一種細(xì)胞都應(yīng)測其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，然后確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間。避免血清干擾，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)空白對(duì)照，與試驗(yàn)平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。最后比色時(shí)，以空白孔調(diào)零。四唑藍(lán)（MTT）法測定細(xì)胞生長曲線及生長速度：MTT法繪制3組細(xì)胞的生長曲線,分別將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液配制成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后接種于96孔板（1X104）/孔，設(shè)立空白組培養(yǎng)7d,每天每組細(xì)胞各取6孔，每孔加入MTT溶液0.5g/L,37C繼續(xù)培養(yǎng)4h,/