基因表達調控 第三課 mRNA水平的研究9-29課件

1、 mRNA分析技術基因mRNA蛋白質多肽鏈基因表達基因表達的變化可以兩個水平進行分析：mRNA 水平 和蛋白質水平mRNA表達變化的檢測方法：Northern blot, RT-PCR(半定量PCR), Real-time PCR (定量PCR), 熒光原位雜交等、基因芯片、高通量測序等mRNA 表達變化的機制的研究方法方法有：啟動子活性分析（轉錄水平分析）、mRNA轉錄效率分析（Nuclear run on）、mRNA穩(wěn)定性檢測（轉錄后水平）一、RNA研究策略和方法RT-PCR, Real-time PCR，Northern blot, RNA酶保護實驗, 差異篩選，基因芯片Total RN

2、A：rRNA約占80-85，tRNA和核內小分子RNA約占10%-15%，mRNA約占1%-5%，瓊脂糖凝膠電泳中只能看到：28S，18S，5S。RNA提取注意事項：要注意RNase的污染，因RNA極易被RNase的降解，操作時應盡量少說話，并在潔凈的環(huán)境中操作，主要防止手、唾液和空氣中RNase的污染；另一方面使用的所有玻璃儀器、移液器、吸頭和離心管都用0.5%DEPC溶液處理過夜,然后高壓滅菌15分鐘.但對于滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNase，可以不經(jīng)處理直接用于提取RNA，實驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經(jīng)常有RNase污染，使用前必須180度干烤8小時或更長時間（玻璃器皿）或

3、用氯仿沖洗（塑料制品）提取用試劑：Trizol reagent（一）RNA的提取（二）RT-PCR（半定量PCR）RT-PCR相關試劑反轉錄引物反轉錄引物1防止RNA的降解，保持RNA的完整性。2. 避免gDNA的污染，用DNase處理。3為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。4內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參 有GAPDH、-Actin等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。5. 稀釋cDNA，內參循環(huán)數(shù)20-26。6. 擴增產(chǎn)物長度300-500 bp。注意事項：引物設計原則在NCBI找到目的基因序列，以

4、CDS區(qū)進行引物設計。1.最好位于編碼區(qū)5端的300-400bp區(qū)域內，可以用DNAman, Alignment 軟件看看結果。2.引物長度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。3.G+C含量在40%-60%之間，45-55最佳。4.引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。5.引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。6.引物5端可以修飾。DNA 或RNA 的絕對定量分析，包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉基因動植物轉基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等?；虮磉_差異分析，例如比較 經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學處理等 ) ，特定基因在不同時相的

5、表達差異以及cDNA 芯片或差顯結果的確證。基因分型，例如SNP檢測，甲基化檢測等。Real-time PCR的應用：BAReal-time PCRRT PCR定量PCR引物設計軟件：Primer bank將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southernblot相同的原理進行轉膜和用探針進行雜交檢測。Northern blot主要用于檢測樣品中是否含有基因的轉錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。（四）Northern blotNorthern blot 流程圖優(yōu)點：northern blot的靈敏度要好于基因芯片實驗，而基因芯片優(yōu)勢在于 它可在一次實驗中同時反映出幾千個基因表達量的變化

6、； 與定量PCR的高靈敏度相比，northern blot較高的特異性可以有效 的減少實驗結果的假陽性。缺點： Northern blot 實驗中要防止RNA的降解，所有實驗用品都需要經(jīng) 過除去RNA酶的過程，如高溫烘烤、DEPC處理等。同時， northern blot中很多實驗用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等對人 體都有一定的傷害。Northern blot 的優(yōu)勢在于它可檢測目的片段的大小、是否具有可變剪切出現(xiàn)、可允許探針的部分不配對性，雜交過后的膜經(jīng)過一定的處理除去探針后還可保存很長時間再次雜交使用。（五）核糖核酸酶保護實驗（ribonuclease protection assa

7、y，RPA）是靈敏度和特異性很高的mRNA定量分析方法 基本原理： 將標記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交，標記的特異RNA探針與目的RNA結合，形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化；而未結合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸。核糖核酸酶保護實驗原理示意圖32P標記的探針：雜交雙鏈進行變性PAGE， 用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測探針的信號；生物素標記的探針：雜交雙鏈經(jīng)過變性PAGE后，電轉移至尼龍膜，用鏈霉親和素辣根過氧化物酶和化學發(fā)光底物與膜上biotin標記的探針結合，X射線膠片或化學發(fā)光圖像分析儀檢測雜交信號。RPA比Northern B

8、lot的優(yōu)勢：1. 過量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，反應更加完全 2. RPA比Northern Blot靈敏15-150倍，適合檢測各種表達水平之基因 3. RPA通量高，同時檢測多個基因，可評價他們在同一情況下的差異表達 4. 一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度可對細胞或組織中原位表達的mRNA進行區(qū)域定位標記探針特異性地與目標靶mRNA序列雜交，檢測標記信號來確定基因在組織和細胞內表達的區(qū)位信息?？勺鳛槎糠治龅难a充。（六）原位雜交（in situ hybridization，ISH）什么情況下選擇原位雜交？沒有合適的抗體，不宜做West

9、ern blot檢測；樣本量太少或比較復雜，不宜提取RNA或蛋白。原位雜交技術主要步驟：材料處理及細胞樣品的固定；樣品的制備和預處理；探針的制備和預雜交；探針及樣品的變性；雜交溫育；檢測雜交信號，進行結果分析。（七）差異表達基因篩選方法表達序列標簽(expressed sequencing tag，EST) 技術，1991差異顯示RT-PCR(different display reverse transcription PCR，DDRT-PCR)，1992 抑制性差減雜交(suppression subtractive hybridisation，SSH)，1996 基因芯片(gene ch

10、ip or micrOarray)基因表達的系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)，1995 基于高通量測序的數(shù)字基因表達譜(DGE)分析轉錄抑制劑：actinomycin D (ActD), 放線菌素D5,6-dichloro-1D-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB),-amanitin (-Am)（八）mRNA穩(wěn)定性分析熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)二、mRNA穩(wěn)定性調節(jié)的機制AU-rich elements (AREs) : AUUUA, 7-9% of cellular mRNAsThese elements

11、 are recognized by trans-acting factors, such as mRNA-binding proteins that bind directly or indirectly to the cis-acting elements and promote the deadenylation and degradation of the mRNA.AU-rich element RNA-binding protein 1 (AUF1), tristetraprolin (TTP) ,KH-type splicing regulatory protein (KSRP)

12、embryonic lethal abnormal vision (ELAV)-like protein 1 (HuR) and polyadenylate-binding protein-interacting protein 2 (PAIP2)（1）AU-rich sequences and mRNA binding proteins（2）Regulatory non-coding RNAmiRNAs act by pairing to the mRNAs of protein-coding genes to direct their repression. lncRNAs show di

13、fferent mechanism of action, varying from chromatin remodeling, transcriptional responses and RNA processing.（3）Alternative polyadenylation (APA)APA consist of two steps, cleavage and polyadenylation of RNAs, which are maturation events that cut and add an oligo(dA) tail to the 3 end of the nascent

14、transcript. This processing protects mRNAs from degradation and increases their stability.The specific cleavage position and the efficiency of the process depend on the interaction between trans-acting polyadenylation factors and cis-elements present in the pre-mRNAs, such as the central sequence motif AAUAAA.Most mRNA regulatory elements are situated within the 5 and 3untranslated regions (UTRs).The mRNA stability is regulated by the complex interplay of cis-acting equences within the 3UTR of the mRNA a