動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)以及核移植

1、關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植第1頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四離體植物器官、組織或細(xì)胞愈傷組織胚狀體植物體脫（去）分化再分化（芽、根）植物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段有哪些？植物組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基： 固體有機(jī)物（蔗糖）植物激素第2頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞A 植物細(xì)胞B 去細(xì)胞壁原生質(zhì)體融合雜種細(xì)胞愈傷組織雜種植株植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞融合1、植物體細(xì)胞雜交的結(jié)果是產(chǎn)生了？2、這個(gè)過程中涉及的原理是？雜種植株細(xì)胞膜的流動(dòng)性 、 植物細(xì)胞的全能性第3頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四多莉克隆猴第4頁，

2、共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四動(dòng)物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體胚胎移植核移植第5頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物機(jī)體內(nèi)取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和增殖。1、概念：一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)第6頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程示意圖關(guān)鍵詞:接觸抑制細(xì)胞貼壁原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)2、過程第7頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四 幼齡動(dòng)物取動(dòng)物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培

3、養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞第8頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四動(dòng)物細(xì)胞生長特性：細(xì)胞貼壁 懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、 易于貼附。細(xì)胞的接觸抑制 當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。第9頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四原代培養(yǎng)(primary culture)傳代培養(yǎng) (subculture)動(dòng)物組織消化后的初次培養(yǎng)。貼滿瓶壁的細(xì)胞需要重新用胰蛋白酶等處理，然后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，讓細(xì)胞繼續(xù)增殖，這樣的培養(yǎng)過程稱為傳代培養(yǎng)。第10頁，共40頁，2022年

4、，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四 接觸抑制(contact inhibition) 細(xì)胞在貼壁生長過程中，隨著細(xì)胞分裂，數(shù)量不斷增加，最后形成一個(gè)單層，此時(shí)細(xì)胞間相互接觸，細(xì)胞分裂和生長停止，數(shù)量不再增加。第11頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四Normal cell Cancer cell第12頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官細(xì)胞懸浮液（單個(gè)細(xì)胞）胰蛋白酶動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。（分解彈性纖維）10代細(xì)胞原代培養(yǎng)50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞株無

5、限傳代細(xì)胞系遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)改變接觸抑制剪碎多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。第13頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四細(xì)胞株：原代細(xì)胞一般傳至10代左右細(xì)胞生長停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，少數(shù)細(xì)胞存活到4050代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞株。 細(xì)胞系：細(xì)胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞系。 細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別： 細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。第14頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四3.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件:1、無菌、無毒

6、的環(huán)境 （添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）2、營養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、促生長因子、無機(jī)鹽、微量 元素、維生素、血清、血漿等。合成培養(yǎng)基）3、溫度和pH (36.5+0.5度, PH=7.2-7.4)4、氣體環(huán)境： O2和CO2（95%空氣和5% CO2 ） 第15頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白細(xì)胞的全能性細(xì)胞株、細(xì)胞系植物體培養(yǎng)結(jié)果快速繁殖、培育無病毒植株等培養(yǎng)目的葡萄糖、動(dòng)物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細(xì)胞增殖原理動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項(xiàng)目4、植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較第16頁，共40頁，202

7、2年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四思考：1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組織培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體？需要脫分化嗎？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。獨(dú)特之處有：1、液體培養(yǎng)基 2、成分中有動(dòng)物血清等不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動(dòng)物個(gè)體不需要。采用定向誘導(dǎo)動(dòng)物的干細(xì)胞。第17頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四5、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用（1）生產(chǎn)蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。（3）用于檢測(cè)有毒物質(zhì)（2）獲得大量自身的皮膚細(xì)胞，用于植皮。（4）用于

8、生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)第18頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四探究1、植物組織培養(yǎng)過程要將組織分散成單個(gè)細(xì)胞嗎？、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程將組織分散成單個(gè)細(xì)胞嗎？、為何動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程將組織分散成單個(gè)細(xì)胞的呢？、如何將動(dòng)物組織分散成單個(gè)的細(xì)胞呢？、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可說明細(xì)胞間的物質(zhì)是什么成份？沒有是成塊的組織細(xì)胞靠在一起,彼此限制了細(xì)胞的生長和增殖，不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng)先用剪刀剪碎,后用蛋白酶處理胰蛋白酶水解蛋白質(zhì)細(xì)胞間的成份是蛋白質(zhì)第19頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四、細(xì)胞膜的主要成

9、份是什么？、胰蛋白酶能將細(xì)胞消化掉嗎？、既然胰蛋白酶能將細(xì)胞消化掉，那將動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞要注意什么問題呢？、能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)取材時(shí)，一般是取胚胎組織或幼齡動(dòng)物的組織或器官，請(qǐng)解釋原因？蛋白質(zhì)和磷脂能注意時(shí)間的控制不能，因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的PH為7.27.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。胚胎組織或幼齡動(dòng)物的組織或器官分裂、增殖旺盛探究第20頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四11、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面為何要光滑、無毒？12、培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)到什么時(shí)候就不再分裂、增殖？13、如此時(shí)細(xì)

10、胞數(shù)量并未達(dá)到人們的需求，應(yīng)該怎樣辦？易于培養(yǎng)細(xì)胞貼壁，進(jìn)行生長增殖當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞分裂就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象叫接觸抑制將貼滿細(xì)胞壁的細(xì)胞用胰蛋白酶處理，然后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，讓細(xì)胞繼續(xù)增殖。這樣的過程叫做傳代培養(yǎng)探究第21頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四14、如何理解原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？15、傳代培養(yǎng)的細(xì)胞都能一直傳代下去嗎？16、有些為何能一直傳下去嗎？17、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是為了得到這些細(xì)胞嗎？18、人類一般保存的是哪類細(xì)胞呢？為什么？上述過程中，在第一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)就是原代培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)移到其它培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)就是傳代培養(yǎng)不都能發(fā)生突變，朝著癌細(xì)

11、胞方向發(fā)展不是保存10代以內(nèi)的細(xì)胞，因?yàn)?050代部分細(xì)胞的細(xì)胞核型可能發(fā)生變化，有少部分遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，發(fā)生突變向癌細(xì)胞方向發(fā)展。探究第22頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體。用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物。1.動(dòng)物細(xì)胞核移植的概念：二、核移植技術(shù)第23頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四2.分類：胚胎細(xì)胞核移植：體細(xì)胞核移植：細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易 細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性困難第24頁，共40頁，2022年，

12、5月20日，12點(diǎn)36分，星期四供體細(xì)胞培養(yǎng)（M卵母細(xì)胞）減數(shù)第二次分裂中期去核的卵母細(xì)胞供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞受體細(xì)胞激活，完成減數(shù)分裂、發(fā)育胚胎移植3. 過程第25頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四卵細(xì)胞母綿羊母綿羊乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育過程融合后的卵細(xì)胞第26頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四4.體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景 1、在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良的進(jìn)程2、保護(hù)瀕危物種3、生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官的移植的供體第27頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分

13、，星期四5.體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題 1、克隆動(dòng)物基因組重新編程的機(jī)制尚不清楚。2、克隆技術(shù)效率低，畸形率高、死亡率高、 易出現(xiàn)早衰等問題。3、生產(chǎn)克隆動(dòng)物費(fèi)用昂貴。第28頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四三、動(dòng)物細(xì)胞融合1、概念：動(dòng)物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交，是指兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的過程。融合后形成的具有兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞稱為雜交細(xì)胞。第29頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四誘導(dǎo)方式物理法化學(xué)法生物法：滅活的病毒仙臺(tái)病毒紫外線喪失感染性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）2、誘導(dǎo)的過程：原理動(dòng)物細(xì)胞融合相當(dāng)于植

14、物體細(xì)胞雜交的原生質(zhì)體融合過程 細(xì)胞膜的流動(dòng)性第30頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四細(xì)胞A細(xì)胞B雜種細(xì)胞物理法、化學(xué)法滅活的病毒仙臺(tái)病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒過程3、用途：制備單克隆抗體第31頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性）第32頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學(xué)方法滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生

15、質(zhì)體融合細(xì)胞融合的方法細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性、植物細(xì)胞全能性原理動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項(xiàng)目植物、動(dòng)物細(xì)胞融合的比較第33頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四四、單克隆抗體單: 單個(gè)細(xì)胞克隆: 無性繁殖抗體: 化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)第34頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四原始的方法獲得抗體，特異性差，純度低。想獲得單一抗體，必須用單個(gè)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，通過克隆形成細(xì)胞群。問題：體外培養(yǎng)的條件下，一個(gè)B淋巴細(xì)胞是不可能無限增值的，如何使單個(gè)淋巴細(xì)胞增殖呢？第35頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四 抗體 抗原刺激效應(yīng)B細(xì)胞篩選單一效應(yīng)B細(xì)胞增殖，產(chǎn)生大量抗體缺點(diǎn)： 特異性差、純度低； 產(chǎn)量低、反應(yīng)不夠靈敏如何解決這一問題？動(dòng)物體內(nèi)第36頁，共40頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)36分，星期四設(shè)計(jì)方案： 一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖雜種細(xì)胞根據(jù)阿根廷科學(xué)家米爾斯坦和德國科學(xué)家柯勒設(shè)計(jì)的 實(shí)驗(yàn)方案