分子雜交課件

1、轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)第二部分：分子雜交Southern BlottingDNA抽提DNA酶切酶切產(chǎn)物電泳轉(zhuǎn)膜烘膜預(yù)雜交探針準(zhǔn)備及標(biāo)記雜交洗膜/顯影1212345679(kb)12335轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理Hind IIIprobe酶切、轉(zhuǎn)膜雜交、顯影不同的插入拷貝產(chǎn)生不同大小的雜交帶HHHH植物總DNA的快速少量抽提（CTAB法）保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性。（3050KB）排除其它分子的污染不存在對(duì)工具酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子。其它生物大分子的污染應(yīng)降到最低程度。DNA純化的要求分離純化核酸總的原則操作步驟：采取新鮮幼嫩葉片在研缽中用液態(tài)氮冷凍，研磨成細(xì)粉； 取

2、約0.4g左右細(xì)粉于1.5ml離心管，加入1ml預(yù)熱至95C以上的1.5CTAB，混勻； 65C水浴中放置30分鐘，每隔5分鐘上下顛倒混合數(shù)次 (DNase變性，促進(jìn)內(nèi)溶物釋放)； 12000g離心2分鐘； 吸取600l上清于新的1.5ml離心管，加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），上下顛倒混合至下層有機(jī)相呈深綠色； 12000g離心5-10分鐘；吸取450l上清于新的1.5ml離心管，加入兩倍體積95乙醇和1/10體積3M NaAc，輕輕的上下顛倒混勻至白色絮狀沉淀出現(xiàn)12000g離心10分鐘；棄去上清。用500l 75乙醇浸洗沉淀5分鐘，除去離子及CTAB殘余，12000g離心5分鐘，棄上

3、清,自然干燥；加入50lTE（含20g/ml RNaseA），放于4C溶解；充分溶解后，測(cè)定并調(diào)整濃度1盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質(zhì)多，必須用10mM的-ME處理2研缽預(yù)凍，粉末轉(zhuǎn)管前至加CTAB前不要融化324:1的苯酚氯仿抽提時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，氯仿的操作要在通風(fēng)柜中進(jìn)行4實(shí)驗(yàn)操作戴手套 思考： （1）試分析DNA降解的可能原因 （2）提高DNA產(chǎn)量的措施本實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)： 氯仿/異戊醇（24:1）：氯仿是有機(jī)溶劑，去除植物色素，蛋白質(zhì)和多糖等，異戊醇可減少蛋白質(zhì)變性過程中氣泡的產(chǎn)生，配合使用兩有機(jī)溶劑，比用單一有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)更有效。DNA沉淀：無水或95的乙醇，異丙醇3M NaAC (

4、或10M NH4AC） 協(xié)助乙醇沉淀DNA。75% 乙醇去除微量Na+、K+、Mg2+等陽(yáng)離子及小分子量的有機(jī)分子，洗脫CTAB所用到的試劑及作用TE（1mM EDTA，10mM Tris.HCl pH8.0）溶解并長(zhǎng)期保存DNA。EDTA螯合Mg2+、Ca2+等二價(jià)陽(yáng)離子，從而抑制DNase等的活性。1.5 CTAB CTAB 15 g 1 M TrisCl (pH 8.0) 75 ml 0.5 M EDTA 30 ml NaCl 61.4 g Add ddH2O to 1000 ml 外環(huán)境條件：pH8.0防止脫氨作用；65 CTAB中DNase變性，促進(jìn)內(nèi)溶物釋放；離心時(shí)15以防CTAB

5、沉淀而降低DNA量。DNA純度：吸光值檢測(cè)：檢測(cè)260nm、280nm吸光值，紫外分光光度計(jì)A260/A280=1.81.9； 1.8最佳，低于1.8說明有蛋白質(zhì)，大于1.8說明有RNA。電泳檢測(cè)DNA大?。涵傊悄z電泳DNA質(zhì)量檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳 帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。 在pH值為8.08.3時(shí)，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)由負(fù)極向正極移動(dòng)。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)像不同的核

6、酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。實(shí)驗(yàn)原理：DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度：影響DNA的遷移率，無離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠

7、并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1TAE，0.5TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0） 實(shí)驗(yàn)步驟：用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺(tái)上；調(diào)整好梳子的高度；稱取0.24 g瓊脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至溫?zé)釙r(shí)倒膠；凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶；將電泳樣品與上樣緩沖液混合后將樣品依次點(diǎn)入加樣孔中；將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動(dòng)（注意點(diǎn)樣孔在電泳槽的負(fù)極一端）；電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5 g/ml的溴化乙錠（EB）中浸泡1015 min，在紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果并照相記錄。電泳指

8、示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenol blue, Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。 1. 含甘油或蔗糖，利于DNA樣品沉入點(diǎn)樣孔中2. 含有電泳指示劑，以指示電泳的進(jìn)程上樣緩沖液：實(shí)驗(yàn)室常用核酸染料EBGel red（UniRed）/Gel greenSybr green ISybr Green II（RNA）Gold View有特定的識(shí)別序列 ，通常為46堿基的回文對(duì)稱序列。切割位點(diǎn)位于識(shí)別序列內(nèi)的固定位置上，切割后在5末端有磷酸基團(tuán)，3末端有羥基。切割后形成粘性末端或平

9、末端，前者又分為3突出端（如PstI）和5突出端(如EcoRI)兩種其活性發(fā)揮只需Mg2作輔酶。II類限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)限制酶的一個(gè)活性單位（1U）：原則上指在50l 反應(yīng)體系中，37下，經(jīng)過1小時(shí)的反應(yīng)將1 g的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的star活性：限制酶在某些極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下對(duì)底物DNA的特異性可能降低，即可將與原來識(shí)別的特定DNA序列不同的堿基序列切斷，這種現(xiàn)象叫限制酶的star活性。它的出現(xiàn)的頻率與酶、底物及反應(yīng)條件有關(guān)。氯化鎂、氯化鈉/鉀、Tris鹽酸鹽、巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性內(nèi)切酶作用的緩沖體系成分包括：注意注意閱讀商家提供的產(chǎn)

10、品說明書，了解所使用工具酶的濃度和最適作用條件，不要用錯(cuò)了buffer和作用的溫度等涉及到酶的操作時(shí),一律在冰上操作使用移液器吸取酶時(shí)，tip頭只能剛剛插入液面吸取如果有多個(gè)反應(yīng)，酶、buffer、水等應(yīng)配制成mixture再分裝各種成分加完后應(yīng)混勻，然后在離心機(jī)上短暫離心檢測(cè)DNA質(zhì)量測(cè)量DNA濃度所有DNA樣品的濃度調(diào)整到大致相同限制性內(nèi)切酶操作準(zhǔn)備：DNA ( g) 10 l10*buffer reaction 2 lEnzyme (10U) 1l (10U/l ) H2O 7 l 20 l酶切體系：注意：冰上操作 1 5 DNA10 l (ddH2O) Hind (10U/l)1 l

11、5 l 10buffer2 l 10l ddH2O 7 l 35 l Total 20 l 37C 酶切過夜酶切體系混勻分裝電泳檢測(cè)酶切效率：每樣品1/10量上樣，電泳檢測(cè)。若呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，則酶切效果好，否則重做 。出現(xiàn)切爛：DNA降解，重新提DNA；切不動(dòng)：雜質(zhì)多（多糖，蛋白質(zhì)，酚類，有機(jī)溶劑等），重新純化。酶切效果檢測(cè)：A1優(yōu)總DNA A2劣總DNA B1 酶切爛 B2酶切優(yōu) B3切不動(dòng)總DNA酶切電泳檢測(cè)1212345679(kb)12335酶切反應(yīng)的終止加入終濃度為12.5m mol/L的EDTA以鰲合鎂離子而終止酶的反應(yīng)多數(shù)酶在65C 10分鐘可被不可逆滅活，少數(shù)65C不失

12、活的酶在75 C 15分鐘也能失活若酶對(duì)熱具完全抗性，可通過酚抽提乙醇沉淀來純化造成DNA酶切不完全的主要原因有：操作不當(dāng)，酶或DNA加至管壁上，反應(yīng)體系沒完全混合；混和后應(yīng)短暫離心；反應(yīng)條件不合適，用錯(cuò)了緩沖液或溫度不合適；酶的活力不夠DNA不干凈，反應(yīng)體系中存在酶的抑制劑；DNA樣品中抑制酶活的污染物主要有：DNA 樣品中的蛋白質(zhì)、多糖、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高濃度的鹽等均能抑制酶切活性解決辦法：增加酶作用的單位數(shù)（10-20U/g DNA)增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制劑延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間消化基因組DNA時(shí)，加入終濃度1-2.5m mol/L多聚陽(yáng)離子亞精胺可改善酶切效果，其作用是結(jié)

13、合帶負(fù)電荷的污染物。純化DNA膠濃度0.7-0.8%。膠厚度 5mm (250ml膠)。膠的均一性(不同樣品的遷移率一致)。樣品DNA量指示劑量稍大，長(zhǎng)時(shí)間指示。點(diǎn)樣順序：marker，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，本組樣品電泳電壓：大電泳槽40V，12小時(shí)，1-1.5V/cm。電泳結(jié)束，指示劑約移動(dòng)10-11cm。電泳轉(zhuǎn)膜的方式：1. Upward Capillary Transfer (Figure 1)2. Downward Capillary Transfer (Figure 2)3.Simultaneous Transfer to Two Membranes4. Electrophoretic

14、 Transfer5.Vacuum Transfer轉(zhuǎn)膜Upward Capillary TransferUpward Capillary TransferDownward Capillary Transfer尼龍膜：高強(qiáng)度，不易破損，與DNA共價(jià)結(jié)合，反復(fù)使用10次以上不破損，不丟失DNA，吸附DNA每cm2比硝酸膜多5倍，50bp有效雜交。硝酸纖維素膜：非共價(jià)結(jié)合，易脆，易丟失DNA，不能與膜結(jié)合。轉(zhuǎn)移緩沖液（transfer buffer）DNA轉(zhuǎn)移的效率較難判斷，只有在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，通過EB染膠，及分子雜交才可以鑒別效率高低，但已無補(bǔ)救措施，因此，每一步應(yīng)嚴(yán)格操作 轉(zhuǎn)膜時(shí)間（duration of transfer，12hrs）取決于毛細(xì)吸附系統(tǒng)膠厚度(5mm)及濃度(1%)大?。悍肿恿看笮Q定時(shí)間長(zhǎng)短，部分去嘌呤減小，堿轉(zhuǎn)hrs大部分結(jié)合到膜。尼龍膜（帶正電荷的）具有較大的DNA結(jié)合容量，它能夠吸附變性DNA，核酸能夠