核酸濃度、純度的檢測(cè)-DNA的電泳檢測(cè)

1、核酸濃度、純度的檢測(cè)DNA的電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)?的原理：掌握紫外分光光度法檢測(cè)DNA濃度和純度的原理。掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的原理技術(shù)技能掌握紫外分光光度法檢測(cè)DNA濃度和純度的步驟和計(jì)算方 法。掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的操作1、DNA分子的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理在中性或偏堿性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移。DNA電泳速率與電荷效應(yīng)無(wú)關(guān)（隨著堿基數(shù)的增加，DNA 分子量增加，電荷數(shù)也增加，這樣荷質(zhì)比基本維持一個(gè)常 數(shù)）。瓊脂糖凝膠作為一種固體支持基質(zhì),主要利用DNA分子在 電場(chǎng)中的泳動(dòng)時(shí)的分子篩效應(yīng)來(lái)達(dá)到分離混合物的目的。在恒電場(chǎng)的一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速率取決于 由D

2、NA分子的大小與構(gòu)型。DNA分子遷移速率與其相對(duì)分子量成反比。700bp900bp電泳方向相同分子量但不同構(gòu)型的DNA分子遷移速率不同。）質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型 (a)松弛線性的DNA（L (b)松弛開(kāi)環(huán)（OC） (c)超螺旋（cccDNA）三種構(gòu)型的質(zhì)粒的電泳模式圖譜影響電泳速率的因素DNA分子量的大小瓊脂糖凝膠的濃度DNA的分子構(gòu)象電壓電泳緩沖液的離子強(qiáng)度瓊脂糖凝膠濃度0.6%1%1.4%2%溴酚蘭的遷移率： 與之相當(dāng)?shù)腄NA大小1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb瓊脂糖凝膠濃度1%1.4%二甲苯青遷移率：與 之相當(dāng)?shù)腄NA大小2Kb1.6Kb1、瓊脂糖2、TBE緩沖液: 臨用時(shí)用水稀至0

3、.5TBE( pH8.08.2)3、核酸電泳的指示劑溴酚蘭：在堿性液體中呈紫藍(lán)色二甲苯青：在堿性液體中呈藍(lán)色在電泳中，溴酚蘭和二甲苯青的遷移率與下列雙鏈線性DNA片段相當(dāng)：試劑4、載樣緩沖液(Loading Buffer)注：指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液， 其作用是：增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)在電泳中形成肉眼可見(jiàn)的指示帶,可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度 和位置使樣品呈色，使加樣操作更方便5、熒光染料(GoldView，GV)GoldView (GV)是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核 酸染料，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同，在 100ml瓊

4、脂糖膠溶液中加入5l GoldView即可。在紫外透射光 下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈DNA呈現(xiàn)紅色熒光。GoldView 不僅能染DNA，也可用于染RNA。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)1.瓊脂糖凝膠的制備 根據(jù)樣品DNA片段大小確定瓊脂糖凝膠濃度； 膠板的制備：膠槽置于水平支持物上（兩側(cè)封口）, 插上樣品梳子, 注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保 持1mm左右的間隙； 膠液的制備：稱(chēng)取0.2g瓊脂糖,置于100ml錐形瓶中,加入 20ml 0.5TBE稀釋緩沖液,用保鮮膜封口（避免水蒸氣 過(guò)度散失），然后在上面用槍頭扎個(gè)小孔（加熱過(guò)程中 可以放出少量水汽，以免瓶?jī)?nèi)壓力過(guò)大）， 放入微波爐 里加熱至

5、瓊脂糖全部熔化（1-2min, 液體變透明）,取出 搖勻（燙手?。?此為1%瓊脂糖凝膠液。待膠冷卻到60 度左右，加入DNA染料Goldview 2 ul，混勻； 倒膠：將膠液緩慢倒入膠板內(nèi)，注意：倒膠時(shí)的溫度不 可太低,否則凝固不均勻；速度也不可太快,否則容易出現(xiàn) 氣泡。 待膠完全凝固后（10min）,撥出梳子,注意不要損傷凝膠, 然后向槽內(nèi)加入0.5TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒(méi)過(guò)凝 膠的上表面。2.加樣：將下列樣品在潔凈的保鮮膜或一次性手套表面混勻，用微量移液槍小心加入凝膠的樣品孔中。8l PCR產(chǎn)物 + 2l6載樣液8l 質(zhì)粒提取物 + 2l6載樣液8l pUC19 質(zhì)粒 + 2l6載樣

6、液(陽(yáng)性對(duì)照)5 lDL2000 Ladder Marker (DNA marker) 5 lEcoR T14Marker (陽(yáng)性對(duì)照)注：注意點(diǎn)樣品要放陰極端！每加完一個(gè)樣品要更換tip頭,以防止互相污染；注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。加樣順序電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓 最高不超過(guò)5V/cm（按兩極間距離計(jì)算出總電壓） 。當(dāng) 溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí),停止電泳。 (125V, 30min)觀察和拍照在透射儀的樣品臺(tái)上鋪一張保鮮膜（全班共用一張保 鮮膜），趕去氣泡，然后將膠槽內(nèi)的膠塊小心滑出至 樣品臺(tái)上面。在300nm波長(zhǎng)紫外透

7、射儀下觀察電泳膠板。DNA存 在處顯示出肉眼可辨的綠色條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng) 戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。 可拍 照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)的預(yù)期結(jié)果PCR產(chǎn)物電泳照片圖1: DNA Marker DL2,0002、3: PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（500bp片段）DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)500bpDL2000PCR產(chǎn)物質(zhì)粒在正常情況下以cccDNA構(gòu)型存在，在提取過(guò)程中由于機(jī) 械力、酸堿度、試劑等的原因，可能會(huì)使DNA鏈發(fā)生斷裂。所以， 多數(shù)質(zhì)粒粗提物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA(cccDNA)；開(kāi)環(huán)DNA(ocDNA）；線形DNA(lDNA)質(zhì)粒DNA

8、瓊脂糖凝膠電泳模式圖2、紫外分光光度法檢測(cè)核酸的濃度、純度基本原理DNA鏈上堿基的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)結(jié)構(gòu)具有吸收紫 外光的性質(zhì)，其最大吸收峰在260nm處。單鏈核酸（RNA）由于其堿基暴露，所以其吸光度較雙鏈高。濃度測(cè)定：在一定范圍內(nèi)，DNA或RNA的光密度OD260與其含量成正比。 當(dāng)使用1cm比色杯，OD2601時(shí)，dsDNA濃度約為50g /ml，RNA濃 度約為40g/ml；寡核苷酸濃度約為30g/ml。根據(jù)以下公式可 以計(jì)算DNA在溶液中的濃度：質(zhì)粒DNA濃度(g / l )=稀釋倍數(shù)OD26050/(1000 L）其中：L為比色杯的光程（杯的厚度）；“50”為DNA在OD260=1時(shí)的

9、 濃度。質(zhì)粒DNA濃度(ng / l )=稀釋倍數(shù)OD26050注：OD260值應(yīng)在01之間，以在0.5左右為好。這樣讀數(shù)比較準(zhǔn)確。純度測(cè)定：當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì) 影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。一般情況下同時(shí)檢測(cè)同一樣品的OD260、 OD280（280nm是蛋白質(zhì)的吸收峰）和OD230（230nm是酚類(lèi)等雜質(zhì)的吸 收峰），計(jì)算其比值來(lái)衡量樣品的純度。經(jīng)驗(yàn)值：純DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染或DNA降解；1.6，表明有蛋白質(zhì)或酚污染） 純RNA： OD260/OD2802.0 (1.8 2.2)實(shí)驗(yàn)步驟取10 l自提的質(zhì)粒DNA溶液

10、用ddH2O稀釋10倍（終體積：100 l）。以蒸餾水作參比，對(duì)儀器進(jìn)行調(diào)零等調(diào)整后，測(cè)定質(zhì)粒樣 品的OD260和OD280。計(jì)算OD260/OD280之比,判斷其純度。計(jì)算質(zhì)粒樣品的濃度：DNA濃度(ng / ul )=稀釋倍數(shù)OD26050島津UVmini-1240紫外分光光度計(jì)的使用步驟1. 打開(kāi)電源，系統(tǒng)開(kāi)始自檢（6min）取3個(gè)比色皿，各加入100ulddH2O,并放入樣品室（最靠近 我們的比色皿（1號(hào)）為對(duì)照）選擇“1. 光度模式”4. 設(shè)置波長(zhǎng)（260nm）: go to WL調(diào)空白： 按“空白”鍵，調(diào)節(jié)不同比色皿透光值誤差自動(dòng)調(diào)零： Auto ZERO，空白樣品透光值歸零取出第

11、二、三號(hào)比色皿，倒掉ddH2O，加入100ul預(yù)先混好 的質(zhì)粒DNA樣品，關(guān)上蓋，按“Start”，開(kāi)始測(cè)量OD260, 記錄結(jié)果設(shè)置波長(zhǎng)（280nm）: go to WL自動(dòng)調(diào)零： Auto ZERO，空白樣品透光值歸零按“Start”，開(kāi)始測(cè)量OD280，記錄結(jié)果。實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 （一）1、記錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒樣品的電泳圖譜，說(shuō)明帶型含義（對(duì)結(jié)果和出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行分析，如若未獲得單一的擴(kuò)增帶， 這是什么原因造成的？擴(kuò)增帶顏色深淺說(shuō)明什么等；將質(zhì)粒 樣品與標(biāo)準(zhǔn)的pUC19質(zhì)粒比較。）2、記錄質(zhì)粒DNA的OD260、OD280等原始數(shù)據(jù)，計(jì)算比值和濃度， 并分析結(jié)果： OD260/OD280比值高或低各說(shuō)明什么？思考題恒定電場(chǎng)強(qiáng)度下，瓊脂糖凝膠電泳只適于分離多大的DNA片段？（20-50Kb）若有60kb100kb大小的系列DNA片段要進(jìn)行分離鑒定，問(wèn)