害蟲是造成農(nóng)林業(yè)減產(chǎn)的重要因素

1、植物抗蟲轉(zhuǎn)基因工程1前言隨著世界人口的不斷增長，持續(xù)提高糧食產(chǎn)量顯得更為迫切。減少病蟲危害的損失是增 加產(chǎn)量的重要途徑。采用噴施化學農(nóng)藥和生物殺蟲劑等手段防治固然可以減輕害蟲對農(nóng)作物 的危害，但前者會造成環(huán)境污染、后者成本較高等。據(jù)統(tǒng)計全球糧食總產(chǎn)量每年因蟲害造成的 損失達14%，直接給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟損失達數(shù)千億美元。我國因蟲害水稻每年減產(chǎn)10%、 小麥減產(chǎn)20%、棉花減產(chǎn)30%以上1。長期以來，農(nóng)作物害蟲防治依賴于合成化學殺蟲劑，盡 管它們?nèi)虻匿N售量每年高達10億美元，但仍未根本控制害蟲的危害，還嚴重污染了環(huán)境、食 物鏈和水資源。因此，減少殺蟲劑使用量，發(fā)展現(xiàn)代植物保護技術(shù)，已成為可持

2、續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè) 中必須正視的課題之一2。自然界有少數(shù)栽培種或品種具有抗蟲性3，在受到害蟲侵襲時，寄主植物常會合成一些化 學保護物質(zhì)，如棉花中的棉酚和油菜中的芥子酸，以阻止害蟲的進一步危害；人們在早期如 對一些害蟲不加防治，有利于植物在后期形成較強的抗性以抵御危害嚴重的害蟲等囹。植物基 因工程克服了傳統(tǒng)育種受基因資源限制的缺陷，它導入的抗性基因不局限于植物，可拓展到 動物、微生物甚至于人工合成的基因，而且允許一次導入多個不同的目的基因，將特定性狀 轉(zhuǎn)入目的遺傳背景的時間明顯縮短。通過常規(guī)育種技術(shù)和試管培養(yǎng)技術(shù)雖然已獲得某些抗蟲害的作物品種。如野生型馬鈴薯 (Solanum chacoense )和栽

3、培型馬鈴薯(S.tuberosum )的原生質(zhì)體電融合獲得的體細胞雜合品 系對一種馬鈴薯甲蟲具有抗性。然而，新品種的選育需要較長的時間，并且某些蟲害尚無基因 資源作為雜交的親本。所以，用這種途徑來獲得抗蟲作物是很困難的。植物抗蟲基因工程是現(xiàn)代生物技術(shù)研究領域的重要成果，它的誕生為害蟲的防治提供了 一條嶄新的途徑。自1987年首次報道抗蟲轉(zhuǎn)基因植物以來，至1995年,抗蟲轉(zhuǎn)基因馬鈴薯進 入商品化生產(chǎn)，次年，抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花和玉米也進入商品化生產(chǎn)。植物抗蟲基因工程的研究 之所以能取得如此迅猛的發(fā)展,主要是由于利用基因工程培育抗蟲作物新品種或新品系具有以 下幾個明顯的優(yōu)點：(1)保護作用具有連續(xù)性，可

4、控制植物整個生長期內(nèi)害蟲的危害;(2)對整 個植株都有保護作用，包括化學殺蟲劑很難接觸的葉下表面及根部等；(3)對害蟲毒性具有專 一性;(4)可大大縮短育種周期，降低成本；(5)所表達出的殺蟲蛋白存在于植物體內(nèi)，不易被 氣候等環(huán)境因素破壞，也不對環(huán)境造成污染;(6)基因資源非常豐富。目前全世界最常改良的性 狀中抗蟲占第二位(24%)5。轉(zhuǎn)基因作物在大田上作大規(guī)模釋放最早的是中國，即抗煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒雙 抗的轉(zhuǎn)基因煙草，轉(zhuǎn)基因煙草1992年在河南就發(fā)展到8600 hm2。1998年5月至今，我國農(nóng)業(yè)部 生物工程安全委員會批準了6種作物準許商品化生產(chǎn)的許可證，分別為耐儲存西紅柿、轉(zhuǎn)查爾

5、酮(CHS)基因矮牽牛、抗黃瓜花葉病毒甜椒、抗黃瓜花葉病毒西紅柿、單價抗蟲棉花、雙價抗 蟲棉花等。而抗蟲棉是我國目前唯一大面積種植并初步實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，2002年 種植面積超210hm2，首次超過全國棉花410 hm2的一半(51%)6。2抗蟲基因及其研究進展人們已從細菌中、植物本身以及昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離到許多抗蟲基因，有許多抗蟲轉(zhuǎn)基 因植物正在進行田間試驗，并有一些品種已商品化。迄今發(fā)現(xiàn)并應用于提高植物抗蟲性的基 因主要有兩類：一類是從細菌中分離出來的抗蟲基因，如蘇云金桿菌毒蛋白基因奩七基因)、異 戊基轉(zhuǎn)移酶基因(ipt)，另一類是從植物中分離出來的抗蟲基因，如蛋白酶抑制劑基因(P

6、I基因)、 淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因等。其中BtS因和PI基因在農(nóng)業(yè)上利用最廣。2.1來源于微生物、細菌中的抗蟲基因2.1.1 Bt殺蟲晶體蛋白基因蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)是一種革藍氏陽性土壤芽孢桿菌，在形成芽孢時， 可產(chǎn)生殺死昆蟲幼蟲的蛋白質(zhì)，即通常所說的殺蟲品體蛋白(insecticidal crystal protein)或8- 內(nèi)毒素(8 - endotoxin)，也稱蘇云金芽孢桿菌毒蛋白(B.t. toxic protein)o它是目前世界上生產(chǎn)量 最大的生物農(nóng)藥殺蟲劑，廣泛用于防治農(nóng)業(yè)、林業(yè)等方面的害蟲。Bt殺蟲品體蛋白是一類 分子量為

7、130160kD的蛋白質(zhì)，在昆蟲中腸堿性和還原性的環(huán)境下，被降解成6575 kD的 活性小肽，并和中腸紋緣膜上的受體結(jié)合。現(xiàn)已證明受體為氨肽酶N和鈣粘著蛋白(cadherin) 類似物。與受體結(jié)合的活性小肽插入到細胞膜上并形成穿孔，使細胞膜周質(zhì)和中膜腔之間的 離子平衡破壞，引起細胞腫脹甚至裂解，從而導致昆蟲癱瘓或死亡9、10。自1901年日本生物學家Iskiwata首次從患猝倒病家蠶中分離出蘇云金桿菌(Bacillus thuringiesis, B.t.)以來，目前已發(fā)現(xiàn)B t對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅 目、食蟲目等昆蟲有毒殺作用，還能防治線蟲、螨、原生動物和扁形動物；B

8、t具有高特異的 殺蟲活性，主要是因為它能產(chǎn)生殺蟲品體蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs)，編碼殺蟲蛋 白的基因稱為品體蛋白質(zhì)基因，簡稱cry基因11、12。Crickmore等13在1995年國際無脊椎動物病理學會年會(SIP)上提出了以殺蟲品體蛋白 氨基酸序列的同源性為唯一依據(jù)區(qū)別Bt基因的新分類系統(tǒng)，現(xiàn)已被各國廣泛采納。同源性在 45 %以下，為第一等級，用阿拉伯數(shù)字表示；同源性在45 %78 %之間，為第二等級，用大寫 英文字母表示；同源性在78 %95 %之間，為第三等級，用小寫英文字母表示；同源性在95 % 以上，為第四等級，用阿拉伯數(shù)字表示

9、。只要滿足來自Bt的伴孢包涵體(品體)，與已知的cry (只有殺蟲活性)或cyt (具有溶血溶細胞作用的27kDa品體蛋白基因)具有高的同源性， 就可以納入這個系統(tǒng)14。自1981年第一個殺蟲品體蛋白基因被克隆和測序以來15，截止到 2004年1月已經(jīng)發(fā)現(xiàn)299種殺蟲品體蛋白基因，分屬于44群(其中cry基因42群，cyt基因2 群)，136模式基因【16、切。最近幾年，又相繼發(fā)現(xiàn)了兼抗鱗翅目和鞘翅目的Bt毒蛋白(CryV)、抗線蟲的Bt毒蛋白 (Cry VI)。大多數(shù)蘇云盡芽孢桿菌株系可產(chǎn)生幾種晶體蛋白(Cry蛋白)，每一種Cry蛋白寄 主范圍相當狹窄切。1987年，世界上有4個實驗室首次報

10、道獲得轉(zhuǎn)Bt殺蟲品體蛋白基因的煙草或番茄植株 19-22，此后Bt基因被相繼轉(zhuǎn)入到棉花、水稻、玉米、蘋果和核桃等作物中。美國用農(nóng)桿菌介 導法將Bt基因?qū)霘ぷ衙?，育成世界上首例抗蟲棉，棉鈴蟲為害率下降50%。1996年美國Bt 基因抗蟲棉種植面積72萬hm2，約占總植棉面積14%。我國是繼美國后育成抗蟲轉(zhuǎn)基因棉的第 二個國家，育成中國第一代單價抗蟲棉的抗蟲性在90%以上，減少用藥60%80%，增產(chǎn) 30%40%。1992年底中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心的郭三堆23等人在國內(nèi)首先人工合成了 Bt基因之后，又對豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpT I)基因進行了修飾，構(gòu)建了同時帶有這兩種基因 的雙價殺蟲基因高

11、效植物表達載體，再通過花粉管通道轉(zhuǎn)化技術(shù)導入我國不同棉花生產(chǎn)區(qū)的 主栽品種，已獲得了數(shù)十個雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉株系。雙價抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花研制成功并大面積 進入田間試驗，目前我國在抗蟲棉方面的研究已取得了較大的進展剖。近年來人們在Bt毒蛋白基因的修飾與改造、表達載體的構(gòu)建、植物組織化、抗蟲植物的 培育等方面作了大量工作25。盡管Bt殺蟲品體蛋白的殺蟲效果非常好，但其殺蟲譜較窄，對其敏感的主要是鱗翅目和 鞘翅目的一些害蟲，如棉鈴蟲、玉米螟、馬鈴薯甲蟲等。目前利用上述這些殺蟲品體蛋白尚 不能控制許多重要的其它農(nóng)業(yè)害蟲的危害，加之絕大部分Bt殺蟲品體蛋白基因需經(jīng)過改造或 重新合成才能提高它們在植物體內(nèi)的表達

12、量，表現(xiàn)出高抗蟲性。因而人們在繼續(xù)發(fā)掘新型的 Bt殺蟲品體蛋白基因的同時，也把注意力部分轉(zhuǎn)向其它來源的抗蟲基因。2.1.2其他來源于微生物的抗蟲基因異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(ipt )是細胞分裂素合成中的關(guān)鍵酶，來源于Agrobacterium tumefaciens 的ipt基因在煙草、番茄中表達后，可減少煙草夜蛾對葉片的損傷，并降低桃蚜的生存力。然 而，ipt基因的表達對植物發(fā)育有負面影響，如使根系發(fā)育不完全，降低葉綠素含量等26。2.2來源于高等植物的抗蟲基因2.2.1蛋白酶抑制基因蛋白酶抑制劑(Proteinase Inhibitor，PI)是自然界含量最為豐富的蛋白種類之一，是植物 天然防御系

13、統(tǒng)中的一部分，可抵抗食草動物的侵食。其機理在于它能與昆蟲消化道內(nèi)的蛋白消 化酶相互作用，形成酶抑制劑復合物，阻斷或減弱消化酶的蛋白酶水解作用，刺激消化酶的 過量分泌，使昆蟲產(chǎn)生厭食反應，導致非正常發(fā)育或死亡。1936年Kunitz等27 首先從牛胰臟中分離出堿性胰蛋白酶抑制因子(basic pancreatic trypsinin hibitor BPTI，也稱kunitz northrop 型抑制因子)。1946年Kunitz28又 從大豆中分離 了胰蛋白酶抑制因子，并將其結(jié)品化，證實了它們均為蛋白質(zhì)，由此揭開了蛋白酶抑制因子 研究的序幕。目前,至少有14種蛋白酶抑制基因轉(zhuǎn)入作物中。其中令人

14、注目的是豇豆胰蛋白酶抑制劑 (CowpeuTrypsin Inbibitor，CPTI)，馬鈴薯蛋白酶抑制劑II基因(Potato Proteinase InhibitorII，PI II)，及水稻巰基蛋白酶抑制基因(Oryzacystatin).Hinder等29應用CaMv35S基因啟動 子使豇豆(Vigna unguiculata)胰蛋白酶抑制劑基因在煙草中行組成型表達，是利用植物自身基 因來控制害蟲的范例。飼喂實驗表明，CpTi 1 %的表達量延緩煙芽夜蛾(H. virescens)幼蟲生 長，增加幼蟲死亡率，減輕植物的損失。田間試驗表明其對玉米夜蛾(H. zea)也有抗性3。 此后，

15、劉春明等克隆了CpTi的cDNA并獲得了轉(zhuǎn)基因煙草31。巰基蛋白酶抑制劑(TPI)對玉 米根部害蟲(Diabrotica spp.)和根結(jié)線蟲有明顯的抑制作用32 。2.2.2淀粉酶抑制劑基因淀粉酶抑制劑基因分布也較廣，以禾谷類作物和豆科植物種子中的含量最為豐富，在植 物對病蟲害侵染的天然防御系統(tǒng)中起著重要的作用33(Richardson,M.，1990)。這類酶抑制劑能 抑制昆蟲消化道內(nèi)a一淀粉酶活性，使食入的淀粉無法水解，阻斷了昆蟲主要能量來源；并刺 激昆蟲過量分泌消化酶，通過神經(jīng)系統(tǒng)反饋產(chǎn)生厭食反應。國外a一淀粉酶抑制劑研究起步較早，早在1933年在小麥以及1945年又在普通大豆上都曾

16、有過報道甲、35。國內(nèi)酶抑制劑方面的研究始于70年代末。福建省微生物研究所從土壤中篩選 到產(chǎn)生粉酶抑制劑的產(chǎn)生菌S-2-35菌株，并對其代謝產(chǎn)物的分離及其理化性質(zhì)進行深入研究， 研究成果顯著聲。2.2.3植物凝集素基因自從Stillmark (1888)首次在蓖麻種子抽提物中發(fā)現(xiàn)一種凝血因子和Sumner第一次分離 純化到植物凝集素伴刀豆球蛋白A (ConA)以來，人們已經(jīng)從豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科和石蒜科等眾多植物類群中分離鑒定出幾百種這類蛋白質(zhì)，并對它們的性質(zhì)、分 子結(jié)構(gòu)及功能作了大量的研究，許多工作已深入到基因水平I。但直到本世紀60年代,人們認 識到凝集素在生物體內(nèi)具有多種重

17、要生理功能，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)上具有巨大應用前景，凝集素 的研究文獻才開始大量涌現(xiàn)。Peumans等認為一蛋白質(zhì)被定義為lectin的唯一前提是至少應有一個非催化結(jié)構(gòu)域，且其 能可逆結(jié)合在特異碳水化合物上。因此，現(xiàn)在植物凝集素定義為：含有至少一個非催化結(jié)構(gòu) 域并能可逆結(jié)合到特異單糖或寡糖上的所有蛋白質(zhì)39。第一個被描述具有抗蟲作用的凝集素是菜豆凝集素(PHA) , 1984年Gatehouse40實驗表 明PHA對四紋豆象的幼蟲具有毒性。1993年英國科學工作者從雪花蓮中克隆出雪花蓮凝集 素基因(GNA)，對稻飛虱、葉蟬、蚜蟲等有毒性作用?，F(xiàn)伯NA基因已作為一種抗蟲基因轉(zhuǎn) 化其他作物。我國黃大昉等(

18、1997)組也報道來源于掌葉半夏和半夏的凝集素對麥管蚜、棉蚜、 桃蚜等有致死作用。凝集素抗蟲的作用機制可能是在昆蟲腸腔部位與糖蛋白結(jié)合，降低膜透 性，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收，同時誘發(fā)病灶，促進消化道內(nèi)細菌繁殖，使昆蟲得病或 引起拒食、生長停滯甚至死亡。目前研究較多的幾種重要凝集素有：豌豆外源凝集素(pea - lectin)、麥胚凝集素(Wheat Germ Agglutinin , WGA)、雪花蓮凝集素(Galanthus Nivalis Agglutinin , GNA)、半夏外源凝集 素(Pinellia Ternata Agglutinin PTA)目前成功用于植物抗蟲基因工程的

19、凝集素基因有:雪花蓮凝 集素(GNA)基因、豌豆凝集素(P -Lec)基因、麥胚凝集素(WGA)基因、半夏凝集素(PTA)基 因。另外有研究報道，稻胚凝集素可以與N-乙酰葡萄胺專性結(jié)合，具有與麥胚凝集素相似 的殺蟲活性，能阻礙昆蟲的正常發(fā)育過程，導致其發(fā)育遲緩甚至死亡。我國王亦菲等(2000)42 以我國普通野生稻基因組DNA為模板，以特異引物經(jīng)聚合酶鏈式反應方法擴增出凝集素基 因，為以后將稻胚凝集素基因應用于轉(zhuǎn)基因植物打下了基礎。凝集素雖可用來殺蟲，但有些 凝集素對哺乳動物也有顯著毒性，如麥胚凝集素、半夏凝集素，這樣就使得這些凝集素不適 合用來轉(zhuǎn)基因。而有些如豌豆凝集素和雪花蓮凝集素對哺乳動

20、物的毒性相對較小，因此大部 分工作集中在了 GNA。GNA對刺吸式口器的害蟲如蚜蟲、褐飛虱等同翅目害蟲及線蟲具有 抗生效應。Gatehouse等(1996)43將GNA基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)GNA可延緩馬鈴薯桃蚜的 發(fā)育期，降低其生殖力，抑制其種群生長。我國袁正強等(2001)申用定點突變方法對編碼 雪花蓮凝集素(Galanthus nivalis agglutinin ,GNA)前體蛋白的DNA序列進行了改造和轉(zhuǎn)基因 煙草(Nicotiana tabacum L .)抗蚜性的研究。結(jié)果表明，將GNA編碼序列中含有的稀有密碼子 改造后，GNA的表達水平從占總可溶性蛋白的0.17%增加到0.25%

21、，轉(zhuǎn)基因煙草的抗蚜性也 隨之增強，從平均抑制桃蚜(Myzusper sicae (Sulzer)蟲口密度63.7%顯著地提高到71.0%。天南星科半夏屬植物三葉半夏(Pinellia Ternata)為我國特有的多年生草本藥用植物，半 夏凝集素(Pinellia Ternata Agglutinin PTA)的粗提液對刺吸式口器的同翅目昆蟲如棉蚜、 桃蚜等有顯著的致死作用。凝膠過濾法測定的PTA分子量為44KDa，由四個約12KDa的亞基 組成，每個亞基具有三個甘露糖結(jié)合位點，與雪花蓮凝集素(Galanthus Nivalis Agglutinin , GNA)的功能相似，具有凝血活性和抗同翅

22、目昆蟲活性，復旦大學姚劍虹等(2003) 45用 RACE -PCR技術(shù)從半夏花序中克隆出半夏凝集素的生長cDNA。通過比較半夏同其他天南星 科植物的凝集素基因序列和推測的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)半夏凝集素基因編碼一具有信號肽的前 體蛋白.半夏凝集素同其他天南星科植物凝集素一樣，為具有3個甘露糖專結(jié)合的凝集素，張 磊等(2003) 46-47構(gòu)建了以CaMV 35S為啟動子，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Npt II)為選擇標記， 帶有半夏凝集素基因PTA的pCAMBIA2200植物雙元表達載體，應用根癌農(nóng)桿WEHA105遺傳 轉(zhuǎn)化了四倍體菘藍。2.2.4來源于高等植物的其他抗蟲基因其他來源于高等植物的抗蟲基因有

23、幾丁質(zhì)酶(Chitinase)、色氨酸脫羥酶(Tryptophan Decaiboxylase , TDC)、核糖體滅活基因(Ribosome Inactive Protein ,RIP)、豌豆脂肪氧化酶(Pea lipoxygenase)番茄素(Tomatime)、多酚氧化酶(PPO)和脂氧化酶(LOX)都對昆蟲有毒害 作用。2.3昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因昆蟲神經(jīng)激素是已知三大昆蟲激素的一種，它控制著昆蟲許多關(guān)鍵的生理過程，影響昆蟲 的生長、變態(tài)、生殖、代謝和行為等，近年來，人們已開始在基因工程中利用昆蟲神經(jīng)激素 防治害蟲。目前已證明轉(zhuǎn)蝎毒素基因的作物對取食的害蟲有毒性48。3新殺蟲基因的應用

24、傳統(tǒng)抗蟲轉(zhuǎn)基因主要是從人們熟知的具有殺蟲能力的生物中克隆出來的，如從蘇云金芽 孢桿菌中克隆Bt殺蟲品體蛋白基因，而蘇云金芽孢桿菌作為生物農(nóng)藥殺蟲劑已在農(nóng)業(yè)上應用 了幾十年。新抗蟲基因除了繼續(xù)從這類已知具有殺蟲能力的生物中克隆外(如營養(yǎng)殺蟲蛋白基 因)，還采用了普遍篩選的方法，即用來作殺蟲實驗的樣本可以是任意來源的植物組織、微生 物發(fā)酵液以及商品化的蛋白質(zhì)等。采用對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害較大，但又不好控制的害蟲作為篩選 實驗對象。一旦出現(xiàn)殺蟲效果明顯的實驗即進行跟蹤鑒定，確定殺蟲物質(zhì)是否為蛋白質(zhì)。如 果是蛋白質(zhì),則根據(jù)此蛋白的功能、殺蟲效率、殺蟲的作用機理來判斷其作為新一代殺蟲蛋白 的潛在價值。第二代抗蟲

25、基因中的膽固醇氧化酶基因就是以此方法發(fā)現(xiàn)并克隆的49。3.1膽固醇氧化酶基因膽固醇氧化酶是膽固醇代謝過程中的一個關(guān)鍵酶，能催化膽固醇分解成4-膽甾烯-3酮 和過氧化氫。膽固醇氧化酶的殺蟲譜相當寬，對鞘翅目、鱗翅目、雙翅目、直翅目和同翅目 的害蟲都有不同程度的作用5。3.2營養(yǎng)殺蟲蛋白基因營養(yǎng)殺蟲蛋白是另一類高效殺蟲蛋白質(zhì)，它的敏感害蟲是另一種對Bt毒蛋白不敏感的重要 農(nóng)業(yè)害蟲鱗翅目的小地老虎。目前已發(fā)現(xiàn)了3個營養(yǎng)殺蟲蛋白：從臘狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)培養(yǎng)物中分離出的Vipl，Vip2和從蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis ) 培養(yǎng)物中分離出的Vip

26、3A。這類蛋白可能與敏感昆蟲表皮細胞，尤其是柱狀細胞相結(jié)合，造成 細胞分解，伴隨著腸道嚴重受損，受害昆蟲迅速死亡。昆蟲攝食Vip3A與Bt毒蛋白致毒表癥類 似，但Vip3A發(fā)癥時間要長些。日前Vip3A基因已獲克隆，對它的研究也比較深入51。4抗蟲基因工程潛在的問題、解決途徑及展望伴隨抗蟲基因工程進展，其在應用方面潛在的問題也日益顯露。近年來，隨著轉(zhuǎn)基因植物的商品化進程加快，有關(guān)生物安全性問題已成為人們研究和關(guān)注 的熱點52-54。4.1抗蟲轉(zhuǎn)基因工程中昆蟲的抗性問題害蟲的抗性是指一個種群在遺傳基礎上降低了對某一種殺蟲劑的敏感性。1988年，Mc Gauhey55報道了倉庫谷物害蟲印度谷螟在B

27、t選擇壓力下，繁殖75代后，對Bt殺蟲劑的抗性增 加9。1。倍。目前較常采用的方法有：1，使用組織特異性表達啟動子和損傷誘導啟動子等特殊的啟動 子56-58； 2，采取2個或2個以上不同殺蟲機理的抗蟲基因同時轉(zhuǎn)入植物中59-60 ； 3，提供“避 難所Peferoen(1997)61等。4.2 基因沉默”現(xiàn)象無論是哪種來源的抗蟲基因用于基因工程首要考慮的問題就是提高其表達量。一般來說， 表達量越高，抗蟲效果就越好。導人的抗蟲基因翻譯水平不高是普遍存在的問題，因此，如 何提高外源抗蟲基因在植物體內(nèi)的表達，是植物抗蟲基因工程的一個重要研究方向62。減少轉(zhuǎn)基因沉默的主要方法有：1)改進轉(zhuǎn)基因方法，盡

28、量避免多拷貝外源基因整合到受 體基因組中；2)篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因個體；3)采用具有特殊功能的啟動子和增強子進行調(diào)控。隨著人們對DNA空間結(jié)構(gòu)、各種調(diào)控因子、環(huán)境因子及發(fā)育因子與轉(zhuǎn)基因表達之間關(guān)系的深 入研究，轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象終將會被克服。4.3轉(zhuǎn)抗蟲基因植物潛在的生態(tài)風險性轉(zhuǎn)抗蟲基因植物的安全性是一個長期、重要而且復雜的問題，應謹慎對待63?？瓜x轉(zhuǎn)基 因植物的直接生態(tài)效應是對靶標昆蟲種群的控制，但靶標昆蟲有無向其他寄主植物轉(zhuǎn)移的可 能；害蟲天敵種群會受到怎樣的影響；次要害蟲是否會變?yōu)橹饕οx；靠轉(zhuǎn)基因作物的逃逸 或從作物雜交中獲取轉(zhuǎn)基因抗性的植物是否會對自然植物群落產(chǎn)生嚴重影響都是需進一步研 究的

29、問題。為了防止轉(zhuǎn)基因植物與它們的野生親緣植物之間雜交，進而減少轉(zhuǎn)基因植物的擴 散。目前，已有學者利用實驗室中的煙草作試驗，把不育基因和不育抑制基因分別嵌入煙草 中，當轉(zhuǎn)基因煙草之間相互授粉后，由于不育抑制基因可以抑制不育基因，使得轉(zhuǎn)基因煙草 可以產(chǎn)生能繁衍的種子。而當轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草間授粉后，不育基因就可以防止不 純煙草種子的萌發(fā)。為了防止選擇基因或報告基因的潛在風險，目前，世界上已有許多實驗 室正在研究無標記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)食4。4.4展望植物抗蟲基因工程在短短十幾年中已取得了豐碩成果，抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花、玉米、馬鈴薯 的商業(yè)化推廣證明了這項技術(shù)的實用性。另外，我們必須認識到，基因工程并非是解決

30、一切 問題的萬全之策，通過植物基因工程得到的只是一種人工種質(zhì)新材料，而不是生產(chǎn)上可以立 即應用的新品種，它必須經(jīng)過常規(guī)育種考驗。只有將傳統(tǒng)的抗蟲育種、遺傳工程及田間綜合 防治相互結(jié)合起來，才能更好地控制害蟲發(fā)生，更好地改良植物。因此，植物基因工程技術(shù) 必須與常規(guī)育種相結(jié)合，并經(jīng)大田試驗將轉(zhuǎn)基因植物的外源目的基因持續(xù)遺傳給后代或通過 有性繁殖轉(zhuǎn)移到其他品種上去?？梢韵嘈牛S著研究的不斷深入，目前存在于抗蟲轉(zhuǎn)基因工 程中的各種問題必將得到解決，必將有更多的抗蟲作物新品種從實驗室走向大田。在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)，抗蟲基因在植物整個生活周期中都存在并行使其抗蟲功能，克服了使 用農(nóng)藥控制蟲害的時效性和易被沖刷

31、、流失、分解等缺點，又防止了化學農(nóng)藥在食物中的殘留 危害人體健康和對環(huán)境造成的污染等問題。多種抗蟲基因的同時開發(fā)及其互補和協(xié)同作用， 對于控制昆蟲產(chǎn)生抗性，提高抗蟲植物的抗蟲能力及抗蟲范圍前景是樂觀的。我國在國家 863計劃的支持下，抗蟲棉研究也取得了巨大的進展，部分品種已推廣大田種植65。但應 該指出，抗蟲轉(zhuǎn)基因植物并不是萬能的，繼續(xù)開發(fā)和利用化學農(nóng)藥，合理的田間生態(tài)控制和生 物防治的綜合應用，才能解決當前日益嚴重的蟲害問題。5參考文獻夏啟中，張明菊?？怪参锵x害基因及其應用。鄂州大學學報，2005 (5)： 56-60馮 英,薛慶中。作物抗蟲基因工程及其安全性。遺傳，2001 (6)： 57

32、1-576Feeney P P. Plant apparency and chemical defense J . Recent Adv Phytochem,1976 ,10 :1 40Agrawal A. Induced responses to herbivory and increased plant performance J . Science ,1998 ,279 :1201 1202張漢堯，劉小珍，楊宇明。植物抗蟲基因工程研究進展。河南農(nóng)業(yè)科學，2005 (3)： 11-15陳業(yè)堅，張增勤等。Bt基因在農(nóng)業(yè)上地應用及其生物安全性。上海農(nóng)業(yè)科技，2005 (2)： 29-30Fis

33、chhoff D A , Bowdish K S , Perlak F J , et al. Biotechnology ,1987 ,5 : 807 813Vadlamudi R K, Weber E , Ji I. J Biol Chem. 1995 ,270 : 54905494Hilder VA，Gatehouse AMR，Sheernan SE，et a1. A novel mechanism of insect resistance engineered intotobaccoJ. Nature，1987，330： 160163Van Rie J， McGaughey WH， Jo

34、hnson DE. Mechanism of insect resistan ce to the microbial insecticideBacillusthuringiensisJ. Science， 1990(247)： 7274伍贈玲，邱君志，張新艷，李訓波，關(guān) 雄。蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白基因定位研究進展。福建農(nóng)林大學學報，2004 (3)： 75-79SCHN EPF H E, CR ICKMORE N , VAN R J , et a l. Bac illus thur ing ien s is and its p es ticida l crys ta l p roteins J

35、 . M icrobiolMolBiol Rev, 1998, 62 (3) : 775- 806Crickmore N , Zeigler D R , Feitelson J , et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. ,1998,62 : 807813林敏.農(nóng)業(yè)微生物基因工程M .北京:中國科技出版社,2000.41724851Schnepf H E , Whiteley H R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981 ,78 : 2893 2897李海濤，王洪成，劉志洋。Bt殺蟲晶體蛋白的研究概述。黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2004 (5)：

36、 37-39Kumar P A , Sharma R P , Malik V S. The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensisJ . Advances in Applied Microbiology , 1997 ,42 : 1243陳云鵬，陳火英，莊天明。B t毒蛋白基因在轉(zhuǎn)基因抗蟲植物中的應用.生物學通 報，2000，35(5):15-17BBarton K A , Whitely H R , Yang N S. Plant physiol. ,1987,85 :1103 1109Fischhoff D A , Bowdish K

37、 S , Perlak F J , et al. Biotechnology ,1987 ,5 : 807 813Hilder V A , Gatehouse A M R , Sheerman S E , et al. Nature ,1987,300 : 160163Vaeck M , Reynaerts A , Hofte H , et al. Nature , 1987,328 : 33 37郭三堆.植物B t抗蟲基因工程研究進展J .中國農(nóng)業(yè)科學，1995, 28 (5) : 813.顧萬榮，李玉俠，張進，毛慶海，葛自強，陳德華。國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉研究進展。安徽農(nóng)業(yè)科學，2005 (2)

38、： 324-325Krattiger AFInsect resistance in crops：A case study of BaciUusthuringiensis an d its transfer to developingCoLIntriesA. ISAAA Briefs No. 2M. ISAAA： Ithaca，NY. 1997. 411Smigocki A. et al. The Role of Transgenic Plants ,1997 ,225236Kunitz M,Northrop J H.Isolation from beef pancreas of crystal

39、line trypsinogen,trypsin,trypsin inhibitor and an inhibitor trypsin compoundJ.J Gen Physiol,1936,(19):991-1007Kunitz M, Crystalline sobean trpsin inhibitor IJ.J Gen Physiol,1946(29):149-154Hilder V A ,Gatehouse A M R ,Sheerman S M, et al. A novel mechanismof insect resistance engineered into tobacco

40、 J .Nature ,1987 ,330 :160163Hoffmann T C ,Zalom F G,Wilson L T , et al. Field evaluation of transgenic tobacco containing genes encoding Bacillus thuringiensis 5-endotoxins or cowpea trypsin inhibitor : efficacy against Helicoverpa zea (Lepidoptera : Noctuidae ) J . J Econ Entomol , 1992,85 : 2516

41、2522劉春明，朱 禎,周兆斕，等.豇豆胰蛋白酶抑制劑抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草的獲得J .科學通報,1992 ,37 (8) :16941697Edmonds H S ,Gatehouse L N ,Hilder V A , et al . The inhibitory effects of the cycteine protease inhibitor ,oryzacystatin ,on digestive proteases and on larval survival and development of the southern corn rootworm( Diabrotica undeci

42、mpunctata howard) J . Entomol Exp Appl ,1996 ,78 :83 94Richardson, M. (1990) Seed storage proteins: the enzyme inhibitors. In Methods in Plant Biochemistry (Rogers, L., ed.) 5,pp. 261 307. Academic Press, London, UKGibbs B F, Alli I. Characterization of a purifieel c-amylase inhibitor from white kid

43、ney beans (phaseolus vulganis). Food Research International, 1998,31:217-225Lajolo F M,Filho F F. Partial characterization of the amylase inhibitor of black beams (Phaseolus vulgaris), variety Rico23. J Agric Food Chem,1985,33:132-138徐成勇，諸葛建。微生物來源的酶抑制劑研究進展。微生物學報，1999, 39 (2)： 185 187Schoreder H E ,G

44、ollasch S ,Moore A , et al . Bean alpha - amylase inhibitor confers resistance to pea weeliv ( Bruchus pisorum) in transgenic peas (Pisum sativum L. ) J . Plant Physiol ,1995 ,107 :12331239高燕會，李潤植，毛雪，李彩霞。植物凝集素的防衛(wèi)功能及其研究進展。世界農(nóng)業(yè)。2000 (12)： 3335Etzler M E ,1985. Plant lectins : Molecular and biological

45、aspects. Ann Rev Plant Physiol ,36 :209234Peumans WJ ,Van Damme E J M,1995. Lectins as plant defense proteins. Plant Physiol, 109 :347352Gatehouse A M R ,Dewey FM,Dove J ,Fenton KA , Pusztai A , 1984. Effect of seed lectins from Phaseolous valgaris on the devolepment of larvae of Callosbrchus macula

46、tus : Mechnism of toxity. J Sci Food Agric, 35 :373380黃大昉，潘映紅，張淑香等。從掌葉半夏中發(fā)現(xiàn)對幾種蚜蟲有致死活性的蛋白。中國農(nóng)業(yè)科學，1997, 30 (2)： 94 96王亦菲，黃劍華，郝崢嶸，劉慶法，曲志才，沈大棱。普通野生稻凝集素基因的克隆及序列分析。上海農(nóng)業(yè)學報， 2000，16(1)：1316Gatehouse, A. M. R., R. E. Down, K. S. Powell, N. Sauvion, Y.Rahbe, C. A. Newell, A. Merryweather, W. D. O. Hamilton &

47、J. A. Gatehouse, 1996. Transgenic potato plants with enhanced resistance to the peach-potato aphid Myzus persicae. Entomologia Experimentalis et Applicata 79: 295-307袁正強，趙存友，周巖，田穎川。雪花蓮凝集素基因(gna)的改造及其抗蚜性。植物學報，2001，43 (6)： 592 597Yao JH, Zhao XY Liao ZH, Lin J, Chen ZH, Chen F, Song J, Sun XF, Tang KX. Cloning and molecular characterization of a novel lectin gene from Pinellia ternata. Cell Res. 2003 Aug;13(4):301-8張磊，許鐵峰，譚秋敏，王子楠，丁如賢，唐克軒，張漢明。四倍體菘藍轉(zhuǎn)抗蟲基因研究I.根癌農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn) 基因菘藍。中草藥，2003 (3)： 258-261許鐵峰，張磊，劉成洪，譚秋敏，唐克軒，郭美麗，喬傳卓，張漢明。四倍體菘藍轉(zhuǎn)抗蟲基因研究II.轉(zhuǎn)半夏凝集 素基因菘藍的分子生物學檢測。中草藥，2003 (9)： 846-849Barton KA ,Miller