QuantiGene Plex 2.0的詳細操作流程(抽濾法)

1、QuantiGenePlex2.0的詳細操作流程（抽濾法）此流程除了洗脫步驟，其他步驟也適用于磁珠洗板機洗脫法，使用的是Panomics公司的試劑。操作流程簡介：目標(biāo)RNA的釋放目標(biāo)RNA的捕獲信號放大4.檢測以下將針對上述四大流程進行詳細的說明。目標(biāo)RNA的釋放：此步流程即為組織細胞勻漿液的制備，鑒于本實驗室所處理樣本的類型，下面只介紹用RNAlater保存的樣本和石蠟包埋切片處理樣本的組織細胞勻漿液制備方法。實驗開始之前，用RNaseZap處理所有物品的表面。保存于RNAlater中的組織其細胞勻漿液的制備方法此步驟不適用于下列類型的樣本：骨肌肉胰腺胃空腸準(zhǔn)備步驟：將新鮮組織放于5倍體積的

2、RNAlater中，4C孵化16-18小時。準(zhǔn)備適量的勻漿溶液，每5mg組織300卩1勻漿溶液3卩1蛋白酶K漩渦震蕩混勻用吸水紙將附在組織上的RNAlater吸除干凈。組織勻漿液的制備。將組織和勻漿溶液轉(zhuǎn)移到Dounce組織研磨器中，加入4-6顆不銹鋼珠和適量玻璃砂，勻漿直至無可見的顆粒。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中。65C孵化勻漿樣品30min，在此過程中每隔1Omin最高速漩渦震蕩lmin。注意：有些組織如連接組織需要更長的孵化時間（最長18h）來減少粘稠性。16,000 xg離心樣品15min，沉淀細胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，重復(fù)此步驟一次。立即使用組織勻漿液或保存于-80C冰箱中。

3、石蠟包埋切片組織勻漿液的制備測量和轉(zhuǎn)移組織。測量長（L）和寬（W）,計算面積（LxW）mm2用干凈的刮刀將FFPE樣品完全刮入1.5ml離心管中，避免刮入過多的石蠟。注意：要保證足量的相當(dāng)于50-60gm厚的組織樣本，如果樣本厚度為10ym，則放5-6片于一個離心管中。溶解組織。a.根據(jù)下表中的體積來加入勻漿液和蛋白酶K對于總厚度為50-60ym厚的組織片組織面積（mm2）勻漿液（卩1）蛋白酶K體積（卩1）25-1003003100-22560062259009b.65C孵化樣本6小時。短暫地漩渦震蕩樣本，每過1小時漩渦震蕩1min。室溫下最大速度離心樣品5min,沉淀細胞碎片，然后將勻漿液轉(zhuǎn)

4、移至新的離心管中,避免石蠟和碎片殘留，如有必要重復(fù)操作來去掉碎片。注意：在室溫下離心會使殘留的石蠟固化，在勻漿液表面會形成固態(tài)的石蠟殘留。用移液管刺穿石蠟層吸取勻漿液轉(zhuǎn)移。立即使用組織勻漿液或保存于-80C冰箱中。目標(biāo)RNA的捕獲Day11.準(zhǔn)備下列試劑ProbeSet和BlockingReagent，融化，短暫漩渦震蕩混勻，短暫離心，收集管底部的物質(zhì)。CaptureBeads，用之前從貯藏處取出，避光。ProteinaseK,用之前從貯藏處取出，置于冰上。組織勻漿液，如果是冷凍的，室溫下融化，37C孵化30min。對于管子，短暫漩渦震蕩，對于板子，上下吹打5次，然后放置在室溫下。注意：不要把

5、樣本重新放回冰上。LysisMixture在37C下預(yù)暖30min,再輕柔地震蕩。用勻漿溶液恰當(dāng)?shù)叵♂尳M織勻漿液，使樣品的需要量為每孔40卩1,要確保實驗信號在儀器所能檢測的范圍內(nèi)和實驗線性范圍內(nèi)。4.通過結(jié)合下表中所列的試劑準(zhǔn)備適量的WorkingBeadMix。注意：在加入之前漩渦震蕩（最高速）CaptureBeads30sec。加入順序試劑1well(gl)48well(gl)96well(gl)1Nuclease-freewater18.51,2402,4792LysisMixture33.32,2314,4623BlockingReagent21342684ProteinaseK0.

6、213275CaptureBeads16713462.0ProbeSet5335670總計604,020&040漩渦震蕩WorkingBeadMix30sec，分別加入HybridizationPlate中，少于48個孔使用單管道移液器，每次轉(zhuǎn)移都要更換一次新槍頭，每孔中加入60glWorkingBeadMix。多于48個孔：用單管道移液器，將WorkingBeadMix轉(zhuǎn)移到25ml試劑儲藏池中。注意：不要傾倒，否則試劑將會出現(xiàn)損耗。使用排槍，每次轉(zhuǎn)移都要更換一次新槍頭，每孔中加入60glWorkingBeadMix。注意：包括3個孔的實驗背景對照加入40卩1的組織勻漿液到含有Working

7、BeadMix的HybridizationPlate中。注意：加入40卩1的勻漿溶劑到作為背景實驗的3個孔中。用壓力封板膜密封HybridizationPlate。將壓力封板膜放于HybridizationPlate中間。用軟橡膠滾壓器，平衡地滾壓封板膜。將HybridizationPlate置于Shakingincubator中。54C1C孵化18-22小時，600rpm信號放大Day2實驗開始之前：將AmplifierDiluent,LabelProbeDiluent,SAPEDiluent放于室溫下。使AmpliferDiluent37C溫暖20min,溶解沉淀，顛倒混勻。準(zhǔn)備WashB

8、uffer：加入1個250ml的量筒中，按下列順序150ml雙蒸水(ddH2O)0.6mlWashBufferComponent110mlWashBufferComponet2用ddH2O將體積補足到200ml注意：每塊板準(zhǔn)備200mlWashBuffer轉(zhuǎn)移到250ml的容量瓶中，來回顛倒混勻。WashBuffer現(xiàn)用現(xiàn)制。重要的預(yù)防措施：避免用手指或臺面接觸過濾板的底部。避免每個孔中的溶液濺出，交叉污染。在抽濾時，真空壓力不要超過1-2英寸汞，否則CaptureBead將會丟失。檢查過濾板底部是否有裂痕，不要使用破裂的板。不要讓FilterPlate在空氣中干燥，當(dāng)抽濾結(jié)束時，立刻關(guān)上真空

9、抽濾裝置，加入后續(xù)溶液。不要壓FilterPlate的頂部，以免造成試劑的損失。盡量減少珠子暴露在室溫下的時間。雜交2.0Pre-Amplifier:準(zhǔn)備2.0Pre-AmplifierWorkingReagent簡短離心2.0Pre-Amplifier，收集管子底部的物質(zhì)。將3612.0Pre-Amplifier加入12ml的AmplifierDiluent中。來回顛倒數(shù)次。注意：AmplifierDiluent是一種粘性溶液，小心吸取保證所有的物質(zhì)從移液管中排出，WorkingReagent完全轉(zhuǎn)移到reagentreservoir中。預(yù)濕過濾板將WashBuffer裝入100mlreag

10、entreservoir中。用鋁箔將不用的孔密封起來。將FilterPlate置于FilterPlateHolder上。FilterPlate每個孔中加入100pl的WashBuffer,室溫下孵化1min。將FilterPlate轉(zhuǎn)移到vacuummanifold上，過濾掉WashBuffer。注意：確保真空過濾器的壓力不超過Hg的1-2inches，抽濾時間是5-15s，必要時調(diào)整壓力。關(guān)掉真空抽濾器，將FilterPlate放回FilterPlateHolder上。將過夜雜交的混合物轉(zhuǎn)移至FilterPlate中。將HybridizationPlate從shakingincubator中

11、取出，240 xg室溫離心1min。注意：調(diào)整shakingincubator的溫度50C1C。上下吹打5次，完全將過夜雜交的混合物轉(zhuǎn)移到FilterPlate中。將FilterPlate轉(zhuǎn)移到vaccummanifoldandfilter上，完全過濾。立刻進行后續(xù)操作。洗掉未結(jié)合的樣本小心地向每個孔中加入200gl的WashBuffer，完全過濾，將真空抽濾器關(guān)掉。重復(fù)上述步驟兩次，一共洗三次。用吸水紙吸一下FilterPlate的頂部和底部，去掉殘留的WashBuffer，將它放回FilterPlateHolder上。D.立刻進行后續(xù)操作。5.開始進行2.0Pre-Amplifierhyb

12、ridizationA.將2.0Pre-AmplifierWorkingReagent轉(zhuǎn)移到25mlreagentreservoir中。每孔中加入1001的2.0Pre-AmplifierWorkingReagent非常輕柔地用鋁箔密封好FilterPlate,用干凈的，干燥的紙巾吸一下FilterPlate的底部。將FilterPlate置于shakingincubator中，50C1C,600rpm孵化1h雜交2.0Amplifier準(zhǔn)備2.0AmplifierWorkingReagent簡短離心2.0Amplifier,收集管底部的物質(zhì)。將36但的2.0Amplifier加入到12ml的

13、AmplifierDiluent中。來回顛倒數(shù)次混勻。洗掉未結(jié)合的2.0Pre-Amplifier從shakingincubator中取出FilterPlate。取下試驗孔的鋁箔封板膜,完全過濾,關(guān)掉真空抽濾機。小心地向每個孔中加入200皿的WashBuffer,完全過濾，關(guān)掉真空抽濾機。重復(fù)上步兩次,一共洗三次。用吸水紙吸一下FilterPlate的頂部和底部，去除殘留的WashBuffer,放回FilterPlateHolder上。立刻進行后續(xù)操作。開始2.0Amplifier雜交將2.0AmplifierWorkingReagent轉(zhuǎn)移到25mlreagentreservoir中。每孔中

14、加入100pl的2.0AmplifierWorkingReagent非常輕柔地用鋁箔密封FilterPlate,用干凈的、干燥的紙巾吸一下FilterPlate的底部。將FilterPlate放入Shakingincubator中，600rpm50C1C孵化1小時雜交LabelProbe準(zhǔn)備LabelProbeWorkingReagent:A.短暫離心LabelProbe,收集管底部的物質(zhì)。往12ml的LabelProbeDiluent中，加入36pl的LabelProbe漩渦震蕩15s混勻洗掉未結(jié)合的2.0Amplifier從shakingincubator中取出FilterPlate。取下

15、試驗孔上的鋁箔封板膜，完全過濾，關(guān)掉真空抽濾機。小心地向每個孔中加入200gl的WashBfer,完全過濾，關(guān)掉真空抽濾機。重復(fù)上述步驟兩次，總共洗三次。用吸水紙吸一下FilterPlate頂部和底部，完全去掉殘留的WashBuffer，放回FilterPlateHolder上。立即進行后續(xù)操作。雜交LabelProbe將LabelProbeWorkingReagent轉(zhuǎn)移到25mlreagentreservoir中。每孔中加入100pl的LabelProbeWorkingReagent非常輕柔地用鋁箔密封FilterPlate，用干凈的、干燥的紙巾吸一下FilterPlate的頂部和底部。將

16、FilterPlate置于shakingincubator中，600rpm50C1C孵化lh結(jié)合SAPE準(zhǔn)備SAPEWorkingReagent短暫漩渦震蕩SAPE混勻，短暫離心收集管底部物質(zhì)。將36但的SAPE加入到12ml的SAPEDiluent中。漩渦震蕩15s，避光洗掉未結(jié)合的LabelProbe從shakingincubator中取出FilterPlate。將試驗孔上的鋁箔封板膜取下，完全過濾，關(guān)掉真空過濾器。小心地向每個孔中加入200皿的WashBfer,完全過濾，關(guān)掉真空抽濾器。重復(fù)上步兩次，一共洗三次。吸干FilterPlate的頂部和底部，去掉殘留的WashBuffer放回F

17、ilterPlateHolder上。立即進行后續(xù)操作。結(jié)合SAPE將SAPEWorkingReagent轉(zhuǎn)移到25mlreagentreservoir中。每孔中加入100pl的SAPEWorkingReagent非常輕柔地用鋁箔密封FilterPlate,吸干FilterPlate的底部。將密封好的FilterPlate置于FilterPlateHolder上，用鋁箔完全包裹好。置于shakingplatform上,室溫600rpm搖30min檢測洗掉未結(jié)合的SAPE將SAPEWashBuffer裝入100mlreagentreservoir中。從shakingplatform中取出Filte

18、rPlate。從試驗孔上取下鋁箔,完全過濾,關(guān)掉真空抽濾器。小心地向每個孔中加入200gl的SAPEWashBfer,完全過濾，關(guān)掉真空抽濾器。重復(fù)上述步驟一次,一共洗兩次,吸干FilterPlate的頂部和底部,放回FilterPlateHolder上。準(zhǔn)備板子用于Luminex分析每個試驗孔中加入130但的SAPEWashBuffer非常輕柔地去掉FilterPlate上的鋁箔，吸干FilterPlate的底部。將密封的FilterPlate置于FilterPlateHolder上，用鋁箔完全包裹。注意：這一步，板子在室溫下黑暗中可放置不超過2h,或4C24h（無搖晃），當(dāng)準(zhǔn)備好讀板時再進

19、行后續(xù)操作。將板子放在shakingplatform上，室溫600rpm2-5min，立刻讀數(shù)。注意：如果一次跑多于1塊板子，將第2塊板子置于室溫下黑暗中（無搖晃）。當(dāng)?shù)?塊板子讀完數(shù)，儀器預(yù)洗結(jié)束，便將第2塊板子放于shakerplatform上，室溫600rpm搖2-5min,立刻讀數(shù)。附錄：Luminex維護定期清理樣品probe/needle。Probe/needle生銹或有鹽類沉淀，應(yīng)該更換。每次實驗后，按下表中列出的步驟來清潔probe/needle。步驟洗滌次數(shù)溶液清潔2x20%漂白劑回洗3xnone乙醇洗3x70%乙醇洗4x蒸餾水關(guān)儀器之前，比上述步驟多一步，浸泡1次，水。Qu

20、antiGenePlex2.0AssayKit中所含的試劑及其儲存條件成分描述儲藏ProteinaseK溶解在液態(tài)緩沖液中的proteinaseK-20CBlockingReagent含有防腐劑的液態(tài)緩沖液-20CLabelProbe液態(tài)緩沖液中的生物素?；墓丫酆塑账?20C2.0Pre-Amplifier溶解在液態(tài)緩沖液中的DNA-20C2.0Amplifier溶解在液態(tài)緩沖液中的DNA-20CAmplifierDiluent含有蛋白和防腐劑的液態(tài)緩沖液2-8CLabelProbeDiluent含有蛋白和防腐劑的液態(tài)緩沖液2-8CSAPE連接抗生蛋白鏈霉素的R-藻紅蛋白2-8CSAPEDi

21、luent含有蛋白和防腐劑的液態(tài)緩沖液2-8CLysisMixture含有防腐劑的緩沖液15-30CWashBufferComponent】溶液15-30CWashBufferComponent2緩沖液15-30CSAPEWashBuffer緩沖液15-30CFilterPlate96孔過濾板15-30CFilterPlateHolder96孔，clearbottom聚丙烯微孔板15-30CPlateSeals涂有膠黏劑的鋁箔封板膜15-30CHybridizationPlate96孔clear聚丙烯板15-30CPressureSealsClear,pressure-activated封板膜

22、用于overnighthybridizationplate15-30C故障排除表1故障原因解決方案組織過濾勻漿液中的所有細胞碎片未清除用“澄清勻漿溶液”過程預(yù)過濾樣品組織是有彈性的難于勻漿這是用RNAlater或RNAlaterICE保存的一個已知現(xiàn)象米用我們推薦的方法來勻漿組織QuantiGene或QuantiGenePlexassays的靈敏性低樣品沒有保存在最佳環(huán)境中導(dǎo)致RNA降解米用panomics的樣本評估對照來評價樣本的量（18sDNA）和樣本的質(zhì)量（28sRNA）。如果樣本的質(zhì)量很差，采用我們推薦的液氮粉碎法未完全的樣本勻漿，勻漿后仍有塊狀的組織使用我們推薦的液氮粉碎法來制備樣本

23、QuantiGene或QuantiGenePlexassays的信號與樣品的稀釋倍數(shù)不成比例不完全的樣品勻漿組織與勻漿液的比例太高減少組織樣品的加入量（根據(jù)推薦的樣品量與勻漿液的比例）信號低或靈敏度差表2可能的原因建議的解決辦法RNA轉(zhuǎn)錄的數(shù)量低于檢測下限增加樣本的加入量信號擴大溶液沒有正確制備小心正確地加入2.0Pre-Amplifier,2.0Amplifier,LabelProbe,SAPE加入話量的稀釋液中充分混勻使用了過期的試劑試劑保質(zhì)期半年次佳實驗條件遵照推薦的孵化時間和溫度，所有的孵化都需震蕩MagneticSeperatioonPlateSAPE光致褪色在實驗過程中SAPE應(yīng)避

24、光不止確地使用Washbuffer用SAPEwashbuffer洗掉未結(jié)合的SAPE儀器的檢測針部分堵塞根據(jù)操作者指南替換和清洗檢測針不完全的細胞裂解見表1信號RNA的降解見表1背景信號過高表3原因解決方法探針沒有預(yù)熱加熱探針到95C5min,置于冰上備用雜父混合物在過夜雜父前置于室溫太長時間減少準(zhǔn)備時間，保證雜父混合液在室溫中的暴露時間不多于10min沒有采用最佳實驗條件嚴(yán)格按照實驗操作流程進行使用了過期的試劑試劑保質(zhì)期半年實驗精確度低（高CV）表4原因解決方法吸取溶液不精確只使用校準(zhǔn)的，精確的移液槍槍頭要插牢每轉(zhuǎn)換一次液體都要更換新的槍頭小心慢慢地移液，避免產(chǎn)生氣泡WashBuffer殘留

25、設(shè)置洗脫機，每個洗脫步驟只有5-iom的殘留樣本不純加熱樣本到37C，溶解沉淀，短暫漩渦震蕩不完全的細胞裂解見表1儀器檢測探針部分堵塞見表2Luminex溶液屮有氣泡檢查luminex探針的高度，然后米取儀器去氣泡方案。確保每個孔包含130卩1的SAPEWashBuffer,Luminex樣品量設(shè)為100卩1使用了含有沉淀的緩沖液加熱到37C30min消除沉淀，輕柔地搖晃珠子的數(shù)量少表5原因解決方法CaptureBeads聚集在儲臧管里在加入WorkingPlexSet之前，漩渦震湯懸浮珠子30sCaptureBeads在轉(zhuǎn)入FilterPlate之前沒有重懸在將雜父混合液轉(zhuǎn)入MagneticSeparationPlate之前，上下吹打雜父盤中的CaptureBeads，使其懸浮。在讀數(shù)之前，MagneticSeperationPlate沒有充分震蕩在讀數(shù)之前，震蕩Magnetic