SARS-CoVS240蛋白與眼部ACE2受體作用機制的研究說課材料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。SARS-CoVS240蛋白與眼部ACE2受體作用機制的研究SARS-CoVS240蛋白與眼部ACE2受體作用機制的研究【摘要】目的：研究SARS冠狀病毒（SARS-CoV）S240蛋白與眼部功能性受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）作用的機制。方法：構(gòu)建SARS-CoVS蛋白融合基因pS240-EGFP，并在哺乳動物細胞中表達；半定量RT-PCR和免疫組化鑒定ACE2在結(jié)膜、角膜中的表達；酶聯(lián)免疫吸附實驗、流式細胞儀檢測法進行SARS-CoVS240蛋白與結(jié)膜、角膜細胞的體外結(jié)合研究。結(jié)果：構(gòu)建了融合基

2、因pS240-EGFP；證實ACE2在結(jié)膜、角膜有表達；結(jié)膜、角膜細胞與SARS-CoVS240蛋白能夠結(jié)合。結(jié)論：結(jié)膜、角膜中存在SARS冠狀病毒的功能性受體，SARS-CoVS240蛋白與結(jié)膜、角膜細胞能夠結(jié)合。本研究對了解SARS的病理機制及進一步研究SARS的防護和治療具有一定的參考意義?！娟P(guān)鍵詞】嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒S240蛋白受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2結(jié)合作用0引言非典型肺炎即嚴重急性呼吸綜合征（severeacuterespiratorysyndrome,SARS），具有高度傳染性與致病性，其致病因子為一種新型冠狀病毒SARS冠狀病毒（SARS-CoV），基因組結(jié)構(gòu)為：5-帽狀

3、結(jié)構(gòu)-復(fù)制酶（rep）-棘突糖蛋白（S）-小包膜蛋白（E）-膜糖蛋白（M）-核衣殼蛋白（N）多聚核苷酸(polyA)尾-3。S蛋白介導了病毒與宿主細胞的結(jié)合，SARS-CoV的功能性受體是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-convertingenzyme2-ACE2）。本研究用293T細胞表達出了包含SARS-CoVS蛋白結(jié)合功能區(qū)域的pS240-EGFP融合蛋白片段，體外培養(yǎng)了人結(jié)膜、角膜細胞，檢測了SARS-CoV的功能性受體ACE2在人結(jié)膜、角膜中的表達，并進行了非洲綠猴腎細胞（VeroE6Cell）、人結(jié)膜上皮細胞、結(jié)膜成纖維細胞和角膜上皮細胞與SARS-CoVS240-EG

4、FP融合蛋白片段的體外結(jié)合實驗研究。1材料和方法1.1材料SARS-CoVS（基因組原型GenBank登錄號為：AY278554）基因片段S（11650nt）DNA片段。ACE2引物序列（accessionnumberAF291820）：上游引物5-CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3，下游引物5-GAGCTAATGCATGCCATTCTCA-3，擴增片段長度為107個堿基。GAPDH:上游引物5-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3,下游引物5-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3，擴增片段長度為100個堿基。由上海博亞生物工程公司合成。PCR產(chǎn)物克隆載體pMD

5、-18T（TaKaRa公司）；質(zhì)粒pEGFP-N1（Clontech公司）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTMReagent（Invitrogen公司）；MammalianProteinExtractionReagent哺乳動物細胞蛋白抽提液（PIERCE公司）；SABC-AP免疫組化染色試劑盒（Santa-Cruz公司）；SARS患者恢復(fù)期血清（使用前經(jīng)56加熱30min進行滅活，獲自北京小湯山醫(yī)院與解放軍309醫(yī)院）。主要抗體：角蛋白KeratinPan，波形蛋白Vimentin，神經(jīng)纖維絲蛋白NFkappaB（上海友誼中聯(lián)生物工程有限公司）；抗鼠辣根標記的二抗（上海華美生物工程

6、有限公司）；羊抗人ACE2多克隆抗體（R&D公司）。組織來源：36mo中期引產(chǎn)胎兒的角膜、結(jié)膜、心、肺組織，男女不限；成人眼球破裂傷摘除的角膜和結(jié)膜組織；尸體解剖的成人心、肺、腦組織由長海醫(yī)院提供。1.2方法1.2.1pEGFP-N1及pS240-EGFP融合蛋白的表達PCR引物：SRF:5-GAATTCGCCACCATGCAGACCTCTAATTTCAGGGTTG-3（斜體為EcoRI酶切位點）；SRR:5-TCTAGATTAGGGATCCATCTCGAGAGGAGTTAACACACCAGTAC-3（斜體分別為XbaI、BamHI、XhoI酶切位點）?；蚬こ谭椒?gòu)建真核表達質(zhì)粒pMD-S2

7、40，進一步構(gòu)建pS240-EGFP融合蛋白表達質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染法將pEGFP-N1、pS240-EGFP分別轉(zhuǎn)染293T細胞并進行克隆培養(yǎng)；細胞蛋白抽提液裂解細胞并進行透析，熒光分光光度計檢測透析前后熒光光度值；Braford法檢測蛋白質(zhì)濃度；WesternBlot法分析基因表達產(chǎn)物。1.2.2ACE2在人結(jié)膜、角膜的表達體外培養(yǎng)人結(jié)膜上皮細胞、角膜上皮細胞、結(jié)膜成纖維細胞并行ELISA法鑒定。抽提組織（或細胞）的總RNA，鑒定RNA純度、濃度和完整性；半定量RT-PCR；瓊脂糖凝膠電泳；經(jīng)復(fù)日紫外及可見圖像識別分析系統(tǒng)（上海復(fù)日科技公司）進行電泳條帶光密度掃描，以光密度積分值比值A(chǔ)

8、CE2/GAPDH代表mRNA的表達水平，實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)使用SAS軟件包處理。免疫組化法檢測組織、細胞中ACE2的表達（SABC法）1.2.3S240-EGFP蛋白與各組織、細胞的結(jié)合免疫酶標技術(shù)ELISA法：透析的各種組織及細胞蛋白抽提液與S240EGFP蛋白進行結(jié)合試驗，分別使用腦組織和Hela細胞及EGFP蛋白作為陰性對照，使用ACE2抗體進行阻滯研究。對所得的A450值進行統(tǒng)計分析，使用SAS軟件包，采用析因方差分析。流式細胞儀及熒光顯微鏡檢測細胞與S蛋白的結(jié)合：檢測結(jié)合后的熒光細胞。2結(jié)果2.1pEGFP-N1及pS240-EGFP融合蛋白的表達質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳（圖1）與DNA

9、測序鑒定證明SARS-CoVS240-EGFP融合基因構(gòu)建正確。轉(zhuǎn)染的293T細胞在410h內(nèi)觀察到綠色熒光，12h后可觀察到明顯熒光。其中pEGFPN1轉(zhuǎn)染細胞的熒光較pS240-EGFP轉(zhuǎn)染細胞的熒光稍強，細胞形態(tài)呈圓形（圖2）。SARS-CoVpS240-EGFP基因表達產(chǎn)物的SDS及WesternBlot分析：相應(yīng)分子質(zhì)量處出現(xiàn)蛋白表達條帶，與理論推算值相符。2.2ACE2在人結(jié)膜、角膜的表達培養(yǎng)的人結(jié)膜上皮細胞、結(jié)膜成纖維細胞和角膜上皮細胞（圖3），ELISA法鑒定細胞屬性正確。抽取總RNA樣品的濃度在0.120.5g/L之間、完整性良好、A260/280比值為1.82.0之間的抽提

10、樣本，進行RT-PCR。半定量統(tǒng)計結(jié)果認為成人肺組織、成人心組織、成人結(jié)膜組織與成人角膜組織間及Vero細胞、結(jié)膜上皮細胞、結(jié)膜成纖維細胞與角膜上皮細胞間ACE2-x與GAPDH-x的比值間的差異有統(tǒng)計學意義；levene法進行組間兩兩比較結(jié)果除了結(jié)膜上皮細胞與角膜上皮細胞間無顯著差異外，其他各組織、細胞間均有顯著差異（圖4）。免疫組化法檢測組織、細胞中ACE2的表達結(jié)果見文獻1。2.3S240-EGFP蛋白與各組織、細胞的結(jié)合免疫酶標技術(shù)ELISA法：細胞及組織蛋白抽提液濃度為10mg/L時，結(jié)膜上皮細胞、結(jié)膜成纖維細胞、角膜上皮細胞、結(jié)膜、角膜組織的蛋白抽提液與pS240-EGFP蛋白出現(xiàn)

11、了比較明顯的陽性結(jié)合反應(yīng)，與VeroE6細胞及心、肺組織蛋白抽提液相比稍弱；HeLa細胞和腦組織蛋白抽提液與pS240-EGFP蛋白均沒有出現(xiàn)陽性結(jié)合反應(yīng)。相同濃度的上述組織、細胞蛋白抽提液中分別加入pEGFP-N1蛋白，均沒有出現(xiàn)陽性結(jié)合反應(yīng)?？瞻讓φ战M為陰性反應(yīng)。相同濃度的VeroE6細胞、結(jié)膜上皮細胞、結(jié)膜成纖維細胞、角膜上皮細胞、心、肺、結(jié)膜、角膜組織蛋白抽提液被ACE2抗體孵育后，與pS240-EGFP蛋白沒有出現(xiàn)陽性結(jié)合反應(yīng)（圖5）。用析因方差分析比較S240和EGFP在不同濃度（1mg/L和10mg/L）下與結(jié)膜上皮細胞、Vero、結(jié)膜成纖維細胞、角膜上皮細胞、HeLa的結(jié)合能力

12、，結(jié)果顯示：S240EGFP的結(jié)合能力比EGFP強，均數(shù)分別為0.2676，0.0092，10mg/L濃度比1mg/L濃度結(jié)合能力強，均數(shù)分別為0.2663，0.0105。在比較的各種細胞中，Vero的結(jié)合能力最強，均數(shù)為0.2661，結(jié)膜成纖維細胞、角膜上皮細胞、結(jié)膜上皮細胞的結(jié)合能力相當，均數(shù)分別為：0.1393，0.1392，0.1377，HeLa的結(jié)合能力最差，均數(shù)為0.01。經(jīng)過比較，以10mg/L濃度的S240與Vero的結(jié)合能力最強，均數(shù)標準差為1.03190.0072。用同樣的方法比較S240和EGFP在不同濃度（1mg/L和10mg/L）下與心、肺、結(jié)膜、角膜、腦5種組織的結(jié)

13、合能力，結(jié)果如下：S240的結(jié)合能力比EGFP強，均數(shù)分別為0.3190，0.0071，10mg/L濃度比1mg/L濃度結(jié)合能力強，均數(shù)分別為0.3177，0.0084。在比較的各種組織中，心、肺組織的結(jié)合能力最強（二者無差異），均數(shù)分別為0.2653，0.2648，結(jié)膜組織和角膜組織的結(jié)合能力為其次（二者無差異），均數(shù)分別為：0.1395，0.1389，腦組織的結(jié)合能力最差，均數(shù)為0.0067。經(jīng)過比較，以10mg/L濃度的S240與肺組織、心組織的結(jié)合能力最強，均數(shù)標準差分別為1.03660.0070，1.03650.0060。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：從細胞熒光指數(shù)觀察，VeroE6細胞、

14、結(jié)膜上皮細胞、結(jié)膜成纖維細胞、角膜上皮細胞與pEGFP-N1蛋白均沒有明顯的結(jié)合；VeroE6細胞與pS240-EGFP蛋白出現(xiàn)了較明顯的結(jié)合，結(jié)膜上皮細胞、結(jié)膜成纖維細胞、角膜上皮細胞與pS240-EGFP蛋白也表現(xiàn)出一定的結(jié)合，但較VeroE6細胞明顯要弱；上述細胞預(yù)先被ACE2抗體孵育后，與pS240-EGFP蛋白的結(jié)合明顯被阻滯；而ACE2同種異型抗體沒有能夠阻滯上述細胞與pS240-EGFP蛋白的結(jié)合（圖6）。3討論呼吸道病毒能夠侵犯眼部，引起眼部的感染，如病毒性結(jié)膜炎和角膜炎等，WHO把淚液作為可能藏有SARS-CoV的體液之一。很多醫(yī)務(wù)工作者如眼科醫(yī)生與患者的眼部近距離接觸，可能

15、形成SARS-CoV在醫(yī)務(wù)工作者和患者之間的傳播。還有可能通過應(yīng)用眼部檢查設(shè)備，造成病毒在患者之間的傳播。因為SARS-CoV的高傳染性和高致病性，目前大多數(shù)有關(guān)SARS-CoV的研究無法使用真正的活病毒來進行，替而代之的是構(gòu)建SARS-CoV的結(jié)構(gòu)或功能蛋白，從蛋白質(zhì)水平進行相關(guān)的研究。SARS-CoVS蛋白屬于I型膜蛋白,為1255個氨基酸殘基組成的病毒表面突起糖蛋白前體，以三聚體形式存在,是構(gòu)成病毒表面冠狀結(jié)構(gòu)的主要成分，也是病毒和宿主細胞受體結(jié)合及病毒誘發(fā)機體產(chǎn)生抗體或細胞性免疫反應(yīng)的重要因子，S蛋白識別和結(jié)合宿主細胞上的受體主要借助于其N端的S1片段2,3。Wong等4研究顯示在S3

16、18-510之間集中了SARS-CoVS蛋白受體結(jié)合區(qū)域，比全長S1蛋白具有更好的可溶性和折疊性，能更有效地結(jié)合ACE2及阻滯S蛋白介導的病毒與細胞之間的結(jié)合。Li等5，Xiao等6，Wong等4，已經(jīng)利用人腎細胞株293或293T細胞表達了重組的全長S蛋白或S蛋白片段，并將其應(yīng)用于SARS-CoVS蛋白的結(jié)合研究。這里，我們成功構(gòu)建了包含SARS-CoVS蛋白結(jié)合功能單位的S240-EGFP融合蛋白，并將其在293T細胞中進行了表達。通過克隆培養(yǎng)轉(zhuǎn)染陽性的細胞，提高了融合蛋白的得率，同時也提高了細胞蛋白抽提液中目的蛋白的濃度，為開展SARS-CoV眼部入侵途徑的研究建立了初步的技術(shù)平臺。SA

17、RS是一種高度傳染性的疾病，主要是通過空氣中的飛沫傳播和糞便傳播，侵犯下呼吸道，進一步導致肺損害和呼吸窘迫7，除此之外的傳播途徑目前還不清楚，尚沒有臨床資料發(fā)現(xiàn)SARS患者有角膜、結(jié)膜感染的眼部并發(fā)癥出現(xiàn)。人類組織中ACE2表達的定位論證可以間接地推斷SARS-CoV的感染途徑和可能的體內(nèi)傳播和復(fù)制路線，實時定量PCR8-12及免疫組化研究表明13ACE2在人肺和小腸上皮細胞中大量表達，提示SARS-CoV入侵可能途徑為呼吸道和胃腸道。本研究用半定量RT-PCR和免疫組化的方法鑒定了ACE2在人結(jié)膜和角膜組織中的表達及不同組織間表達的差異，證實人角膜和結(jié)膜組織及人結(jié)膜上皮細胞、角膜上皮細胞和結(jié)

18、膜成纖維細胞中存在ACE2的表達，但表達量較人心、肺組織和VeroE6細胞要少。研究表明2,3,5,14-18，ACE2的表達量的多少與細胞與SARS-CoVS蛋白的結(jié)合能力有一定關(guān)系，而細胞結(jié)合研究中人結(jié)膜上皮細胞、角膜上皮細胞和結(jié)膜成纖維細胞與SARS-CoVS蛋白結(jié)合的能力與VeroE6相比明顯要弱，這一結(jié)果與半定量RT-PCR的研究結(jié)果相符。分析原因可能還有：結(jié)膜和角膜細胞中ACE2的表達主要位于胞漿，細胞膜上表達較少，無法充分發(fā)揮受體的功能；我們構(gòu)建的pS240-EGFP蛋白片段是通過轉(zhuǎn)染的細胞裂解、抽提蛋白質(zhì)而得到的，蛋白片段較大，而且沒有進行蛋白質(zhì)純化，一定程度上影響了其與ACE

19、2受體的結(jié)合；已經(jīng)有一些研究證實13,19-21，雖然有些細胞和組織含有ACE2的表達，但是并沒有發(fā)現(xiàn)這些細胞和組織中有SARS病毒的復(fù)制和基因表達，其中的原理尚不十分明確，可能與病毒入侵這些組織和細胞需要某些輔助因子或復(fù)合受體有關(guān)；雖然新加坡22的研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SARS患者的淚液中存在SARS-CoV，但目前尚沒有臨床資料證實SARS患者出現(xiàn)病毒性結(jié)膜炎和角膜炎的并發(fā)癥，這些與我們的研究結(jié)果有某些相似。當然，如果能夠利用非洲綠猴等SARS-CoV易感動物進行SARS-CoVS蛋白的在體結(jié)合研究甚至進行SARS-CoV活病毒的在體研究則能更加確鑿地得到SARS-CoV眼部親嗜性的證據(jù)?！緟⒖?/p>

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