原料乳及液態(tài)乳中舒巴坦的測定

1、 附件2原料乳及液態(tài)乳中舒巴坦的測定BJS 201702范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了原料乳及液態(tài)乳中舒巴坦的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于原料乳及液態(tài)乳（酸奶除外）中舒巴坦的測定。原理原料乳或液態(tài)乳用酸性水溶液超聲提取，離心后上清液用固相萃取小柱凈化，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定和確證，外標(biāo)法定量。試劑和材料注：水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。3.1 試劑3.1.1甲醇（CH3OH）：色譜純。3.1.2乙腈（CH3CN)：色譜純。3.1.3乙酸（CH3COOH）：分析純。3.2 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品的分子式、相對分子量、CAS登錄號見表1，純度99%。表1 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品的中文名稱、英文

2、名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量舒巴坦Sulbactam68373-14-8C8H11NO5S233. 243.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.3.1舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品（3.2）0.01 g（精確至0.000 1 g），用水溶解并定容至100 mL，標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度為0.1 mg/mL，貯存于4冰箱中，有效期3個月。3.3.2舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)儲備液（3.3.1）1.00 mL于100 mL 的容量瓶中，用水定容至刻度，配得濃度為1.0 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。3.4 0.2%乙酸水溶液：準(zhǔn)確量取2 mL乙酸（

3、3.1.3），用水定容至1 000 mL。3.5 HLB固相萃取小柱，200 mg/6 mL，或相當(dāng)者。3.6 微孔濾膜，0.22 m，有機(jī)相。儀器和設(shè)備4.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。4.2 超聲波清洗器。4.3 渦旋混合儀。4.4 分析天平：感量分別為0.01g和0.000 1 g。4.5 氮吹儀。4.6 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速8 000 r/min。分析步驟5.1 試樣制備5.1.1 提取稱取試樣5 g（精確至0.01 g），至25 mL比色管中，加入15 mL 0.2%乙酸水溶液（3.4），渦旋30 s，超聲提取20 min，用0.2%乙酸水溶液（3.4）定容至25 mL

4、，渦旋混勻，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管內(nèi)，8 000 r/min離心10 min，取上清液待凈化。5.1.2 凈化HLB固相萃取小柱（3.5）預(yù)先用5 mL甲醇（3.1.1）和5 mL0.2%乙酸水溶液（3.4）進(jìn)行活化，取10mL離心上清液（5.1.1）流經(jīng)小柱，待上清液自然流盡后，用5 mL0.2%乙酸水溶液（3.4）淋洗，用吸耳球吹出小柱中殘留液體，加5 mL甲醇（3.1.1）洗脫，收集洗脫液，采用氮?dú)鈱⑾疵撘壕徛蹈桑瑴?zhǔn)確吸取2 mL水溶解殘渣，經(jīng)0.22 m濾膜（3.6）過濾作為測定液，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。5.2 空白試驗除不加試樣外，均按5.1測定步驟進(jìn)行。5.3 儀器參考條件

5、5.3.1液相色譜分離條件a）色譜柱：C18色譜柱，50 mm4.6 mm（i.d.），1.8 m，或性能相當(dāng)者。b）流動相：A：水，B：乙腈（3.1.2），梯度洗脫條件見表2。c）柱溫：25。d）流速：0.3 mL/min。e）進(jìn)樣量：20 L。表2梯度洗脫表時間（min）流動相A（%）流動相B（%）流速（mL/min）0.09550.31.09550.33.05950.35.05950.35.19550.38.09550.35.3.2質(zhì)譜參考條件a）離子源：電噴霧離子源（ESI）。b）掃描方式：負(fù)離子掃描。c）干燥氣：氮?dú)?，溫?50，流速10 L/min。d）霧化器：氮?dú)猓瑝毫?0 ps

6、i。e）毛細(xì)管電壓：4 000V。f）檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。g）質(zhì)譜參數(shù)見表3。表3 舒巴坦的質(zhì)譜參數(shù)化合物定性離子對m/z定量離子對m/z裂解電壓V碰撞能量eV舒巴坦232.1140.1232.164.0232.1140.1704305.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取空白試樣按照5.1步驟制備空白基質(zhì)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（3.3.2）用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋得到所需濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按濃度從低到高依次經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。舒巴坦的LC-MS/MS 多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)量色譜圖參見附錄A中的圖A.1。5.5 定性測定在相同試驗條

7、件下，試樣中待測物質(zhì)的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的保留時間偏差在2.5%之內(nèi)；且試樣中定性、定量離子的相對豐度比與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的定性、定量離子的相對豐度比進(jìn)行比較，若偏差不超過表4規(guī)定的范圍，可判定為試樣中含有對應(yīng)的待測物。表4 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差相對豐度（%）502050102010允許偏差（%） 20 25 30 505.6 定量測定本方法采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程，以試樣的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。待測物的響應(yīng)值均應(yīng)在線性范圍內(nèi)。結(jié)果計算試樣中舒巴坦的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（1）

8、計算獲得：X=CVfm （1）式中：X試樣中舒巴坦的含量，單位為微克每千克（g/kg）；C試樣中舒巴坦峰面積對應(yīng)的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V試樣定容體積，單位為毫升（mL）；m試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；f 稀釋倍數(shù)； 計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。其他本方法對原料乳和液態(tài)乳（酸奶除外）中舒巴坦的檢測限為0.3 g/kg，定量限為1.0 g/kg。附錄A舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)量色譜圖總離子流圖定量離子m/z 140.1定性離子m/z 64.0圖A.1 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)量色譜圖本方法負(fù)責(zé)起草單