生殖發(fā)育毒性和其試驗(yàn)要求與評(píng)價(jià)方法

1、生殖發(fā)育毒性和其試驗(yàn)要求與評(píng)價(jià)方法一、 生殖毒性試驗(yàn)與評(píng)定二、發(fā)育毒性試驗(yàn)與評(píng)定一、生殖毒性試驗(yàn)與評(píng)定外來(lái)化合物對(duì)生殖過程的損害作用，即生殖毒性。生殖毒性可發(fā)生于妊娠期，也可發(fā)生于妊娠前期和哺乳期。生殖毒性試驗(yàn)主要研究外來(lái)化合物對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)生、卵細(xì)胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳過程的損害及其評(píng)定。過去也稱為繁殖試驗(yàn)。生殖毒性試驗(yàn)的目的在于了解外源化學(xué)物及其代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體成年哺乳動(dòng)物的生殖功能和生育力的影響。多代繁殖試驗(yàn)在整個(gè)生命期內(nèi)接觸受試化學(xué)物，更符合人類實(shí)際生活中長(zhǎng)期低劑量接觸食品添加劑、微量重金屬、農(nóng)藥及環(huán)境污染物的情況。（1）試驗(yàn)方法原則生殖毒性試驗(yàn)多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔

2、。大鼠自然受孕率較小鼠為高，較為理想。一般設(shè)三個(gè)劑量組，另設(shè)對(duì)照組。最高劑量組劑量應(yīng)該超過預(yù)期人類實(shí)際接觸水平，希望能使親代動(dòng)物出現(xiàn)輕度中毒，但不出現(xiàn)死亡或死亡率不超過10%，也不能完全喪失生育能力。低劑量組的親代動(dòng)物不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀。另設(shè)中間劑量組應(yīng)僅能出現(xiàn)極為輕微的中毒癥狀。中間劑量與高劑量和低劑量應(yīng)呈等比級(jí)數(shù)。動(dòng)物接觸受試物的方式應(yīng)參照人類實(shí)際接觸途徑。一般可混入飼料或飲水中，由動(dòng)物攝取；也可采用灌胃或膠囊法。利用大鼠或小鼠進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，每組雌雄各1620只，或雌性1620只，雄性810只。（2）試驗(yàn)方法三代兩窩生殖試驗(yàn)大鼠斷奶或出生8周后，開始喂受試物或以其它方式與受試物接觸，共進(jìn)

3、行812周，即直到性發(fā)育成熟，相當(dāng)出生后4個(gè)月左右。每周至少稱體重一次，記錄進(jìn)食量并觀察有無(wú)中毒癥狀或死亡。將雌雄親代動(dòng)物（F0）同籠交配，雌雄比例為11或21，直到受孕或進(jìn)行3周為止。雌鼠受孕后即單籠飼養(yǎng)，繼續(xù)接觸受試物。交配3周后，如仍未受孕，則停止交配，并進(jìn)行生殖器官病理學(xué)檢查。確定是否受孕的方法是每日清晨進(jìn)行雌性動(dòng)物陰道涂片，檢查有無(wú)精子；亦可檢查陰道有無(wú)陰栓出現(xiàn)，以確定受精日期。小鼠陰栓可在陰道口存留較長(zhǎng)時(shí)間，但在大鼠極易脫落，次晨檢查時(shí)往往在籠下糞便盤中檢出。發(fā)現(xiàn)陰栓或檢出精子，即為受孕0日，也有作為受孕第1日。親代動(dòng)物（F0）所生仔鼠為第一代（F1）。出生后應(yīng)檢查每窩幼仔數(shù)、死亡

4、數(shù)以及肉眼可見幼仔畸形。出生后第4天和第21天逐個(gè)稱取重量，仔鼠斷奶后，母鼠休息10天，再與雄鼠交配一次，并生出第二窩仔鼠，親代共生出仔鼠兩窩，分別為F1a和F1b。F1b出生后，將雄性親鼠淘汰，雌性親鼠繼續(xù)喂受試物，直至F1b出生后21天斷奶為止。F1a斷奶后觀察其發(fā)育情況，不再喂受試物。F1b斷奶后，繼續(xù)接觸受試物8 12周，直到性發(fā)育成熟，選出雌雄各1620只，按前法進(jìn)行交配。F1b所產(chǎn)第一窩幼仔為F2a，F(xiàn)2a斷奶后，其母鼠F1b休息10天，再次交配，所生幼仔為F2b，F(xiàn)2b斷奶后，將F1b淘汰。F2b交配處理方法與F1b相同。但F2b也可只交配一次，所產(chǎn)仔鼠為F3a，不再進(jìn)行第二次交

5、配，試驗(yàn)結(jié)束。F0（斷奶或出生周） FbFaFbFbFaFa給予受試物8到12周 第一次交配第二次交配觀察三個(gè)月，喂飼普通飼料，觀察其生長(zhǎng)發(fā)育情況 斷乳后給予受試物到周 觀察三個(gè)月，喂飼普通飼料，觀察其生長(zhǎng)發(fā)育情況 斷乳后給予受試物到周 F0（斷奶或出生周） 2兩代一窩和一代一窩生殖試驗(yàn)近年來(lái)許多國(guó)家與機(jī)構(gòu)多規(guī)定采用兩代一窩或一代一窩試驗(yàn)法。兩代一窩生殖試驗(yàn)法基本程序與三代兩窩試驗(yàn)法相同，但只進(jìn)行到第二代F2，每代只交配一窩。 兩代一窩生殖試驗(yàn) F2斷奶，檢查發(fā)育情況F2出生，每窩留只幼仔F交配斷奶，給予受試物F1（每窩選留幼仔只，雌雄各半）第1619周雌雄交配出生第8周給予受試物（F0）在上

6、述各種生殖毒性試驗(yàn)中，根據(jù)哺乳動(dòng)物全部生育繁殖過程，可觀察下列4個(gè)指標(biāo)：1受孕率反映雌性動(dòng)物生育能力以及雌性動(dòng)物受孕情況。 受孕率= 100%妊娠雌性動(dòng)物數(shù)交配雌性動(dòng)物數(shù)（三）觀察指標(biāo)2正常分娩率反映雌性動(dòng)物妊娠過程是否受到影響。正常分娩率= 100%正常分娩雌性動(dòng)物數(shù)妊娠動(dòng)物數(shù)3幼仔出生存活率反映雌性動(dòng)物分娩過程是否正常，如分娩過程受到影響，則幼仔往往在出生4天內(nèi)死亡。幼仔出生存活率= 100%出生后4天存活幼仔數(shù)分娩時(shí)出生幼仔數(shù)4幼仔哺乳成活率反映雌性動(dòng)物授乳哺育幼仔的能力。幼仔哺乳成活率= 21天斷奶幼仔存活數(shù)出生后4天幼仔存活數(shù)100%（四）結(jié)果判定將試驗(yàn)組動(dòng)物各項(xiàng)觀察指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與對(duì)

7、照組動(dòng)物進(jìn)行比較，如試驗(yàn)動(dòng)物在交配、妊娠、幼仔存活、幼仔發(fā)育（哺育）等方面受到影響，則說明受試物對(duì)動(dòng)物繁殖功能有損害作用。二、發(fā)育毒性試驗(yàn)與評(píng)定1. 基本概念發(fā)育毒性指出生前經(jīng)父體和（或）母體接觸外源理化因素引起的在子代到達(dá)成體之前內(nèi)出現(xiàn)的有害作用，包括結(jié)構(gòu)畸形、生長(zhǎng)遲緩、功能障礙及死亡。能造成發(fā)育毒性的物質(zhì)稱為發(fā)育毒物?；危褐赋錾耙蛩匾鸢l(fā)育生物體的嚴(yán)重的解剖學(xué)上形態(tài)結(jié)構(gòu)的缺陷。致畸性和致畸作用：均指在妊娠期（出生前）接觸外源性理化因素引起后代結(jié)構(gòu)畸形的特性或作用。變異：是由遺傳和遺傳外因素控制的外觀變化，或由于分化改變而引起的中途歧異。2. 發(fā)育毒性的表現(xiàn) 生長(zhǎng)遲緩即胚胎與胎仔的發(fā)育過

8、程在外來(lái)化合物影響下，較正常的發(fā)育過程緩慢。 致畸作用由于外來(lái)化合物干擾，活產(chǎn)胎仔胎兒出生時(shí)，某種器官表現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。致畸作用所表現(xiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，在出生后立即可被發(fā)現(xiàn)。功能不全或異常即胎仔的生化、生理、代謝、免疫、神經(jīng)活動(dòng)及行為的缺陷或異常。功能不全或異常往往在出生后一定時(shí)間才被發(fā)現(xiàn)，因?yàn)檎Ｇ闆r下，有些功能在出生后一定時(shí)間才發(fā)育完全。胚胎或胎仔致死作用某些外來(lái)化合物在一定劑量范圍內(nèi)，可在胚胎或胎仔發(fā)育期間對(duì)胚胎或胎仔具有損害作用，并使其死亡。具體表現(xiàn)為天然流產(chǎn)或死產(chǎn)、死胎率增加。發(fā)育毒性研究的目的是通過計(jì)數(shù)胚胎或胎仔吸收或死亡數(shù)，測(cè)量胎仔的重量和性別比，檢查外觀、內(nèi)臟和骨骼的形態(tài)，來(lái)識(shí)別

9、受試物有無(wú)對(duì)胚胎或胎仔的致死、致畸或其他毒性作用。 最佳聯(lián)合方案是對(duì)成年動(dòng)物進(jìn)行染毒并包括子代從受精卵到性成熟所有生長(zhǎng)發(fā)育階段。 觀察期應(yīng)貫穿一個(gè)完整的生命周期，以檢測(cè)近、遠(yuǎn)期效應(yīng)。 最常選用的方案為三階段試驗(yàn) 。三段生殖試驗(yàn)圖解 生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn) 胚體胎體毒性試驗(yàn)（致畸試驗(yàn)） 出生前后發(fā)育毒性試驗(yàn)I 階段試驗(yàn) 雌雄交配前-受孕-雌性受精-雌性著床期間染毒 研究對(duì)成年雌雄性的生殖功能、配子的發(fā)生及成熟、交配行為、受精、著床前的發(fā)育和著床的影響階段試驗(yàn) 從著床到硬腭閉合期間染毒 研究對(duì)成年雌性生殖功能、胚胎發(fā)育、器官形成期的發(fā)育毒性 階段試驗(yàn) 從著床到幼仔斷乳期間對(duì)孕（乳）母染毒 從

10、著床到子代性成熟的母體生殖毒性（妊娠、分娩和哺乳）和子代的發(fā)育毒性（胚胎、胎兒生長(zhǎng)發(fā)育，新生幼仔宮外生活的適應(yīng)性，斷乳前后的生長(zhǎng)發(fā)育，獨(dú)立生活能力和性功能成熟） 人、大鼠和家兔的致畸作用關(guān)鍵期的比較，短線表示“靶窗”3. 發(fā)育毒性作用評(píng)價(jià)發(fā)育毒性主要表現(xiàn)為致畸作用，所以發(fā)育毒性作用評(píng)價(jià)主要是評(píng)價(jià)受試物的致畸作用。通過致畸試驗(yàn)可以確定一種受試物是否具有致畸作用。致畸試驗(yàn)是檢查受試外源化學(xué)物能否通過妊娠母體引起胚胎毒性或后代畸形的動(dòng)物試驗(yàn)。胚胎在器官形成期，可因受到化學(xué)物或放射性物質(zhì)的作用，使細(xì)胞分化、器官形成和正常發(fā)育受到阻滯，以致出現(xiàn)胎仔器官的器質(zhì)性缺陷而呈現(xiàn)畸形。1. 母體效應(yīng): 受試物對(duì)母

11、體產(chǎn)生了損害作用，從而影響了正常妊娠，而不是對(duì)胚胎的直接損害。2. 胚胎效應(yīng): 受試物對(duì)胚胎的直接損害作用。3. 出生前胎兒效應(yīng): 出生胎兒出現(xiàn)外表或內(nèi)臟畸形。4. 出生后效應(yīng): 引起子代的生理功能或生理結(jié)構(gòu)的缺陷。如后天生長(zhǎng)發(fā)育或生殖功能受影響。致畸作用包括：受試動(dòng)物接觸外源化學(xué)物的方式與途徑應(yīng)與人體實(shí)際接觸情況一致，一般多經(jīng)口給予，雌鼠妊娠的第715天染毒，常用灌胃方式。 試驗(yàn)期間每23天稱取孕鼠體重。通過體重變化可觀察受試動(dòng)物的妊娠情況和胚胎發(fā)育情況。受孕鼠的體重如持續(xù)增長(zhǎng)，則表示妊娠過程及胚胎發(fā)育正常；如體重停止增長(zhǎng)或下降，可能由于受試物的毒性作用或母體的其它原因，引起胚胎死亡或流產(chǎn)。

12、傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗(yàn)（1）動(dòng)物選擇 （2）劑量分組（3）動(dòng)物交配處理 （4）胎仔檢查（5）數(shù)據(jù)處理（6）結(jié)果評(píng)定（1）動(dòng)物選擇 致畸試驗(yàn)的動(dòng)物選擇，除參照毒性試驗(yàn)中選擇動(dòng)物的一般原則（食性和對(duì)受試物代謝過程與人類接近，體型小，馴服，容易飼養(yǎng)和繁殖及價(jià)廉）外，還應(yīng)特別注意妊娠過程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多和胎盤構(gòu)造及厚度與人類接近等特點(diǎn)。根據(jù)上述原則綜合考慮，致畸試驗(yàn)可選用二種哺乳動(dòng)物，一般首先考慮大鼠，此外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高，每窩產(chǎn)仔810只，易于得到足夠標(biāo)本數(shù)；而且經(jīng)驗(yàn)證明，大鼠對(duì)大多數(shù)外來(lái)化合物代謝過程，基本與人類近似，故可首先考慮。小鼠自然畸形發(fā)生率較大鼠高，但低于家兔，對(duì)形成腭裂的致

13、畸物更較敏感。家兔為草食動(dòng)物，與人類代謝功能差異較大，妊娠期不夠恒定，有時(shí)延長(zhǎng)至36天，自然畸形發(fā)生率也較高。（2）劑量分組致畸試驗(yàn)中劑量分組的一般原則是一方面要求出最大無(wú)作用劑量，以及引起致畸的閾劑量，同時(shí)還要保持母體生育能力，不致母體大批流產(chǎn)和過多胚胎死亡，也應(yīng)避免較多母體死亡。高劑量組：LD50的1/5或1/3。 原則是引起母體輕度中毒，死亡率10%;低劑量組：LD50的1/301/100。 原則是不引起母體的任何中毒癥狀。中劑量組：在高、低劑量之間成等比關(guān)系。 原則是只引起母體極輕微毒性反應(yīng)?；蛘咭詫?shí)際接觸量為低劑量，以其10倍量為高劑量。（3）動(dòng)物交配處理 將性成熟雌雄動(dòng)物按雌雄l1

14、或21比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機(jī)分入各劑量組和對(duì)照組。由于致畸作用有極為明確的敏感期，應(yīng)精確掌握動(dòng)物接觸受試物的時(shí)間，必須在器官發(fā)生期。如提前在著床前接觸，將影響受精卵的著床。如在胚胎發(fā)育的最初階段，例如裂卵期和囊胚期接觸受試物，往往可使胚胎死亡，不能造成畸形。如在器官發(fā)生期以后接觸受試物，則各種器官已發(fā)育成熟，致畸作用不易表現(xiàn)。只有器官發(fā)生期的胚胎，對(duì)致畸物最為敏感，易于出現(xiàn)畸形。接觸受試物的方式與途徑應(yīng)與人體實(shí)際接觸情況一致，一般多經(jīng)口給予。也可采用灌胃方式，以保證劑量準(zhǔn)確，效果較混入飼料喂給為好。在特殊情況下，也可采用腹腔注射法，效果與經(jīng)口近似。試驗(yàn)期間每23天稱取母鼠體重。

15、一方面可根據(jù)體重增長(zhǎng)，隨時(shí)調(diào)整給予受試物的劑量，同時(shí)也可觀察受孕動(dòng)物的妊娠情況和胚胎發(fā)育情況。受孕動(dòng)物的體重如持續(xù)增長(zhǎng)，則表示妊娠過程及胚胎發(fā)育正常；如體重停止增長(zhǎng)或下降，可能由于受試物的毒性作用或母體的其它原因，引起胚胎死亡或流產(chǎn)。（4）胎仔檢查鼠類有食畸形胎仔的習(xí)性，應(yīng)在預(yù)期分娩前1 d2 d處死母鼠進(jìn)行檢查。 一般大鼠在受孕后第1920d，小鼠第1819d。 剖檢前稱量并記錄母鼠最終體重。 常采用頸椎脫臼法或斷頭處死法處死動(dòng)物。 從腹中線剖腹，暴露子宮和卵巢，為胎仔檢查做準(zhǔn)備。 活產(chǎn)胎仔取出后，先檢查性別，逐只稱重，并按窩計(jì)算平均體重，然后由下列幾方面進(jìn)行畸形檢查：外觀畸形肉眼檢查，例如

16、露腦；肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，例如腭裂；骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等?；螜z查只限活產(chǎn)胎仔。以上檢查只能檢出結(jié)構(gòu)與形態(tài)異常的畸形，不能檢出可能發(fā)生的生化功能或神經(jīng)行為缺陷。因此有人主張將試驗(yàn)雌鼠保留1/4左右，待其自然分娩，并將出生幼仔飼養(yǎng)觀察，至少到斷奶，以便檢查可能存在的先天缺陷和生理功能異常。表7-3 常見的外觀畸形頭部 軀干 四肢 頭部 軀干 四肢 無(wú)腦 腦鼓出 小頭 顏面裂 開眼 脊柱裂 脊髓鼓出 胸骨裂 腹裂 鎖肛 前或后肢形成不全 多指(趾) 少指(趾) 畸形指(趾) 并指(趾) 單鼻孔 無(wú)耳 無(wú)鄂或小鄂 兔唇 無(wú)頜或小頜 卷尾 短尾 無(wú)尾 短指(趾) 表7-4 常見

17、的內(nèi)臟畸形頭部 胸部 腹部 嗅球發(fā)育不全 無(wú)腦 腦室擴(kuò)張 腦室積液 無(wú)眼球 小眼球 鼻中隔缺損 左心位 右大動(dòng)脈弓 心房(室)中隔缺陷 食管閉鎖 肺發(fā)育不全 肺葉融合 膈疝 肝分葉異常 無(wú)腎 腎積水 馬蹄腎或不對(duì)稱移位 輸尿管積水 無(wú)膀胱 無(wú)睪丸或無(wú)卵巢、子宮，睪丸發(fā)育不全(單側(cè)或雙側(cè)) 表7-5 常見的骨骼畸形 部位畸形及特征顱骨 枕骨 頸椎骨 胸骨 肋骨 腰椎 四肢骨 尾椎骨 盤骨缺損、骨化遲緩(表現(xiàn)為囟門過大) 缺損、缺失 缺損、椎弓不連續(xù)、骨化遲緩 缺損或消失、骨化遲緩、點(diǎn)狀或不到正常的1/2 多肋(正常大、小鼠有13對(duì)肋骨)、少肋、短肋、分叉肋、波狀肋 缺失、分裂變形 多骨、缺失 缺

18、失 缺失、椎弓不連續(xù)、融合表7-6 致畸試驗(yàn)記錄內(nèi)容 動(dòng)物交配給受試物期解剖檢查時(shí)胎仔檢查動(dòng)物編號(hào)動(dòng)物種、品系交配時(shí)周齡確認(rèn)受孕臨床癥狀進(jìn)食進(jìn)水量受試物及溶劑劑量給樣途徑給樣期限母體解剖所見卵巢重量黃體數(shù)著床數(shù)胎盤重量胎仔子宮內(nèi)位置死胎數(shù)活胎數(shù)胎仔重體表檢查骨骼檢查內(nèi)臟檢查（5）數(shù)據(jù)處理在致畸試驗(yàn)結(jié)果評(píng)定時(shí)，主要計(jì)算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)。計(jì)算畸胎總數(shù)時(shí)，每一活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)一種或一種以上畸形均作為一個(gè)畸胎。計(jì)算畸形總數(shù)時(shí)，在同一幼仔每出現(xiàn)一種畸形，即作為一個(gè)畸形；如出現(xiàn)二種或二個(gè)畸形，則作為二個(gè)畸形計(jì)，并依此類推。計(jì)算時(shí)還要對(duì)劑量效應(yīng)（反應(yīng)）關(guān)系加以分析。更重要的是按下列指標(biāo)將各劑量組與對(duì)照組結(jié)果進(jìn)行比較。 活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)：即根據(jù)出現(xiàn)的畸形總數(shù)，計(jì)算每個(gè)活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)的畸形平均數(shù)。對(duì)較為重要的畸形，還可分別單獨(dú)進(jìn)行計(jì)數(shù)?；町a(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)= 畸形總數(shù)活產(chǎn)幼仔總數(shù)畸形出現(xiàn)率：即作為畸胎的幼仔在活產(chǎn)幼仔總數(shù)中所占的百分率。出現(xiàn)畸形的胎仔總數(shù)畸胎出現(xiàn)率= 100%活產(chǎn)胎仔總數(shù)母體畸胎出現(xiàn)率：即出現(xiàn)畸形胎仔的母體在妊娠母體總數(shù)中所占的百分率。計(jì)算出現(xiàn)畸形母體數(shù)時(shí)，同