微生物限度檢查方法適用性試驗模板2015版藥典

1、驗證文件類 別： 編 號：部 門：XXXX微生物限度檢查方法適用性試驗方案XXXXX公司2016年第 2 頁 共 18 頁鹽酸咪達普利微生物方法驗證報告 XXXX微生物限度檢查方法適用性試驗方案審批起草起草部門簽 名日 期質量管理部年 月 日審核審核部門簽 名日 期質量管理部年 月 日批準批準人簽 名日 期 年 月 日目 錄1、 適用范圍2、 目的3、概述4、適用性所需要的儀器設備及文件5、可接受的限度范圍標準6、測試方法7、異常情況處理8、測試結果9、結論10、再適用性周期11、附表 1、適用范圍本適用性方案適用于XXXX微生物限度檢查的方法適用性試驗。2、目的因中華人民共和國藥典（2015

2、年版）頒布實施，為確保該產品的微生物限度檢查方法的可靠性和可操作性，故對其檢驗方法進行適用性試驗，以符合中華人民共和國藥典規(guī)定。3、概述3.1根據中華人民共和國藥典2015年版 四部通則1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法、1106非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法，對XXXX進行需氧菌、霉菌和酵母菌、大腸埃希菌檢查方法的適用性試驗，以確認供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性。3.2適用性試驗時間及批號： 年 月 日開始分別對 、 、 三批XXXX進行獨立的方法適用性試驗。3.3驗證小組部門姓名職務職責4、儀器設備及文件4.1需用儀器設備器具名稱規(guī)格型號儀器編號檢定日期檢定單位有效

3、期4.2文件及存放地方資料名稱存放地點5、可接受的限度范圍標準5.1XXXX微生物限度檢查質量標準項目標準規(guī)定需氧菌總數霉菌和酵母菌總數控制菌不得檢出大腸埃希菌（1g）5.2需氧菌、霉菌和酵母菌計數方法采用中華人民共和國藥典2015版四部通則1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法中敘述的平皿法中的傾注法?？刂凭鷻z查方法采用1106非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法中大腸埃希菌檢查方法6、測試方法6.1供試品 XXXX 批號： 6.2培養(yǎng)基及菌種6.2.1采用符合中國藥典規(guī)定的干燥培養(yǎng)基，并經過培養(yǎng)基適用性檢查。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基 批號： 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 批號：沙氏葡萄糖瓊脂

4、培養(yǎng)基 批號： 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 批號：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 批號： 麥康凱液體培養(yǎng)基 批號： MUG培養(yǎng)基 批號： 6.2.2菌種均購于：菌種名稱編號購入日期傳代日期傳代次數枯草芽孢桿菌第 代金黃色葡萄球菌第 代銅綠假單胞菌第 代大腸埃希菌第 代白色念珠菌第 代黑曲霉第 代6.3菌液制備6.3.1需氧菌、霉菌和酵母菌的檢查菌液制備6.3.1.1接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌適量至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中， 3035培養(yǎng)1824小時，取上述培養(yǎng)物一定量用PH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成制成適宜濃度的菌懸液，備用。6.3.1.2接種白色念珠菌適量至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，2

5、025培養(yǎng)23天，取上述培養(yǎng)物一定量用PH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液，備用。6.3.1.3接種黑曲霉適量至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)57天，加入35ml的含 0.05（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含 0.05（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液，備用。菌懸液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在28可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28，在適用性過程的貯存期內使用。6.3.2控制菌的檢查菌液

6、的制備接種大腸埃希菌適量至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中， 3035培養(yǎng)1824小時，取上述培養(yǎng)物用PH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成制成適宜濃度的菌懸液，備用。菌懸液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在28可在24小時內使用。菌落數確認稀釋級別104稀釋級別105稀釋級別106稀釋級別107枯草芽孢桿菌（cfu/ml）金黃色葡萄球菌（cfu/ml）銅綠假單胞菌（cfu/ml）大腸埃希菌（cfu/ml）白色念珠菌（cfu/ml）黑曲霉（cfu/ml）6.4需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數計數方法適用性試驗6.4.1供試液的制備取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100m

7、l，制成1：10的供試液。6.4.2實驗步驟6.4.2.1試驗組 分別取5份1：10的供試液各10ml分別加入0.1ml試驗菌液（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）混勻，使每1ml供試液中含菌量不大于100cfu。取1ml含試驗菌液的供試液分別注入無菌平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿。另取1ml含白色念珠菌和黑曲霉的供試液分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿。按平皿法測定其菌落數，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基用于需氧菌總數計數，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌、酵母菌總數計數。6.4.2.2供試品對照組

8、取制備好的供試液，以稀釋液替代菌液同試驗組操作。6.4.2.3菌液組 取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。6.4.2.4陰性對照 取相應稀釋液代替供試液和菌液同試驗組操作。6.4.3培養(yǎng)和計數： 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在3035培養(yǎng)35天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在2025培養(yǎng)5天，觀察菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌落數，計數并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。點計菌落數后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規(guī)則報告菌數。若同稀釋級別兩個平板的菌落平均數不小于15，則兩個平板的菌落數不能相差1倍或以上。6.4.4計算公式

9、6.4.5結果判斷試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.52范圍內，可用所用的供試液制備方法及計數方法進行該供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數。若還存在一株或多株試驗菌的回收達不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢査。6.5控制菌 大腸埃希菌6.5.1供試液制備取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1：10的供試液6.5.2試驗分組6.5.2.1試驗組 取制備好的1:10的供試液10ml，加入0.1ml含菌數50100cfu的大腸埃希菌菌懸液，置100ml滅菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置3035培

10、養(yǎng)1824h。6.5.2.2供試品組取制備好的1:10的供試液10ml，置100ml滅菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置3035培養(yǎng)1824h。6.5.2.3陰性對照組取制備好的PH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml，置100ml滅菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置3035培養(yǎng)1824h。6.5.2.4陽性對照組取稀釋液10ml代替供試液，加入0.1ml 50100cfu的大腸埃希菌菌懸液，置100ml滅菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置3035培養(yǎng)1824h。6.5.3取上述培養(yǎng)物1ml，接種至100ml的麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244培養(yǎng)2448小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱

11、瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872小時。若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。大腸埃希菌的鑒定應顯MUG與靛基質陽性。6.5.4結果判斷若試驗組檢出試驗菌，可按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法適用性試驗。7、異常情況處理嚴格按照微生物限度檢查法操作，如在檢測中出現不符合要求的情況出現，分析問題原因后，決定是否需對本方案中設定的XXXX的微生物限度檢查方法進行修改，并重新