細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)4

1、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 陳軼霞 劉俊林 實(shí)驗(yàn)報(bào)告書寫要求：1、學(xué)生實(shí)驗(yàn)后應(yīng)按時(shí)完成并提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。報(bào)告要求結(jié)構(gòu)完整、內(nèi)容充實(shí)、圖表齊全、書面整潔、分析討論認(rèn)真合理等。2、嚴(yán)禁互相抄襲實(shí)驗(yàn)報(bào)告，發(fā)現(xiàn)雷同實(shí)驗(yàn)報(bào)告一律視為不及格。3、切忌全班同學(xué)統(tǒng)一打印相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖（以前曾發(fā)生過全班同學(xué)共用一張錯(cuò)誤的圖的情況）實(shí)驗(yàn)一 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室介紹及使用衛(wèi)生要求 【目的與要求】1.了解細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)施和布局2. 掌握細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的使用衛(wèi)生要求【基本原理】細(xì)胞培養(yǎng)必須無菌操作，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素影響，應(yīng)建立專門的實(shí)驗(yàn)室并劃分不同功能區(qū)。理想的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室可分為準(zhǔn)備室

2、、更衣室、緩沖室、培養(yǎng)室等。【內(nèi)容與方法】1通過教師講解并參觀了解開展本課程教學(xué)的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的布局、設(shè)施與儀器設(shè)備的擺放情況2.使用衛(wèi)生要求。（1）實(shí)驗(yàn)室的消毒實(shí)驗(yàn)室日常采用紫外燈消毒；按實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生管理要求對實(shí)驗(yàn)室潔凈區(qū)按周期進(jìn)行熏蒸消毒；在培養(yǎng)期間發(fā)生嚴(yán)重污染時(shí)要進(jìn)行熏蒸消毒。（2）培養(yǎng)工作開始操作前將所有培養(yǎng)用的物品經(jīng)專用物流通道通過傳遞窗放進(jìn)培養(yǎng)室，開紫外燈消毒30min，關(guān)紫外燈后方進(jìn)入操作。配有空氣凈化系統(tǒng)的潔凈室在風(fēng)機(jī)開啟至少30min后才能達(dá)到相應(yīng)的潔凈度級別。（3）操作者進(jìn)入培養(yǎng)室時(shí)要遵守的程序a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。b: 換穿無菌室專用鞋，進(jìn)入更衣

3、室，外衣掛到指定的衣柜里，用0.1%新潔爾滅溶液對手及前臂進(jìn)行消毒，戴帽子（不露頭發(fā)）、口罩（應(yīng)包住胡須），穿已消毒的潔凈服，進(jìn)入緩沖室。再用0.1%新潔爾滅溶液對手及前臂消毒，在其滯留3min后進(jìn)入培養(yǎng)室。 （4）開超凈工作臺10min，期間用0.1%新潔爾滅溶液的擦拭操作臺面后可開始具體的操作，同時(shí)點(diǎn)燃酒精燈用于臨時(shí)性的火焰消毒。（5）實(shí)驗(yàn)完畢，關(guān)閉超凈工作臺，及時(shí)清理實(shí)驗(yàn)用品，廢物從通往物流通道的傳遞窗中傳出。工作臺面用0.1%新潔爾滅溶液的擦拭消毒后方可出培養(yǎng)室。（6）出培養(yǎng)室時(shí)，將工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔離鞋柜里，跨過隔離鞋柜，將用過的一次性帽子、口罩、鞋套

4、等放到指定的廢物桶，出實(shí)驗(yàn)室前用肥皂洗手，關(guān)閉空氣凈化系統(tǒng)，開紫外燈30min。注：(不寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告)實(shí)驗(yàn)二 細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備與器材【目的與要求】1.了解細(xì)胞培養(yǎng)常用設(shè)備與器材；2.掌握常用設(shè)備的基本操作程序及使用注意事項(xiàng)【內(nèi)容與方法】1通過教師講解了解細(xì)胞培養(yǎng)常用設(shè)備的種類、使用注意事項(xiàng)以及常用器材。2通過教師講解和演示，學(xué)生進(jìn)行操作練習(xí)。常用設(shè)備：C02培養(yǎng)箱、電熱干燥箱、冰箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、過濾除菌裝置、純化水裝置、細(xì)胞冷凍貯存器、離心機(jī)、天平、移液器、血球計(jì)數(shù)板、高壓蒸汽消毒裝置等。常用器材：玻璃器皿： 培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、離心管、注射器、儲(chǔ)液瓶、吸管、載玻片、蓋玻片、漏斗、燒杯、量

5、筒等。塑料品： 冷凍管、多孔培養(yǎng)板、離心管等。器械： 解剖刀、眼科剪和鑷、中號圓頭鑷、止血鉗等。橡膠制品：各種規(guī)格膠塞。雜用品： 金屬飯盒、試管架、記號筆、搪瓷盤、吸頭、酒精燈、酒精、碘酒棉球瓶和火柴等。吸管筒等。注：（不寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告）準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)要求：整理常用器械并置于瓷盤內(nèi)，以便演示講解。實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)器材的清洗、包裝和滅菌【目的與要求】掌握細(xì)胞培養(yǎng)常用實(shí)驗(yàn)器材的清洗、包裝、滅菌方法以及注意事項(xiàng)?！緦?shí)驗(yàn)原理】離體條件下，細(xì)胞對任何有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。因此，細(xì)胞培養(yǎng)器材清洗的要求要比普通實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)格的多，應(yīng)按不同器材的清洗、包裝和消毒程序分別、分類處理?！酒鞑呐c試劑】剪

6、刀、棉繩、棉花、牛皮紙、記號筆、飯盒、吸管筒、燒杯、清潔液、三蒸水等。【內(nèi)容與方法】1.各實(shí)驗(yàn)組準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的器材，如吸管、注射器、培養(yǎng)皿、青霉素瓶、鹽水瓶、培養(yǎng)瓶、瓶塞、眼科剪及鑷子等。2.清洗步驟浸泡于水中的使用過的玻璃器材、膠塞煮沸，加入適量洗滌劑繼續(xù)煮10min刷洗流水振蕩沖洗瀝水清潔液浸泡24小時(shí)流水振蕩沖洗1520遍瀝水蒸餾水沖洗3次50烤干，待包裝。3包裝清洗后的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等器材用牛皮紙進(jìn)行嚴(yán)密包裝，封閉器材使用端，標(biāo)記器材手持端，以便于消毒和貯存。吸管的手持端加棉塞后單獨(dú)包裝或放入吸管筒；瓶蓋、膠塞包裝（5-10個(gè)/包）或放入鋁飯盒。4消毒濕熱滅菌：將

7、包裝好的物品放入壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，15磅，20min。干熱消毒：主要用于玻璃器皿消毒， 160維持90120min。注：（不寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告）準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)要求：1、將清洗場所擺置整齊，比如清洗用洗盆、凳子、毛刷擺放整齊；2、放置3桶純凈水，并做好順序標(biāo)記以方便學(xué)生完成沖洗流程；3、配置好清潔液，并事先放入適量玻璃器皿以備教學(xué)之用；4、安排好烘干烤箱，并分別張貼好：“自來水沖洗烘干烤箱”和“純凈水沖洗烘干烤箱”；5、準(zhǔn)備好包裝所用的用品及器械，供教學(xué)時(shí)演示。實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制 【目的與要求】1. 掌握完全培養(yǎng)液、Hanks液等常用細(xì)胞培養(yǎng)用液的配置及過濾除菌方法。2. 培養(yǎng)無菌意識和無菌操作?！緦?shí)

8、驗(yàn)原理】細(xì)胞培養(yǎng)離不開細(xì)胞在體外生存和生長的各種溶液，即培養(yǎng)用液。培養(yǎng)用液主要包括培養(yǎng)液、平衡鹽溶液、血清以及消化液、pH調(diào)整液和抗生素液等。配置容器要嚴(yán)格清洗、消毒。要明確標(biāo)注所配液體名稱及配制日期。制備好的培養(yǎng)用液要及時(shí)消毒除菌并分裝, 在適當(dāng)?shù)臈l件下貯存?！酒鞑呐c試劑】過濾器、試劑瓶、燒杯、容量瓶、吸管、移液器、KCl、KH2PO4、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4.7H2O、酚紅、DMEM、血清、雙抗、5.6%的NaHC03 溶液、三蒸水等【內(nèi)容與方法】1. 各組配制500mL D-Hanks液（1）用數(shù)滴5.6%的NaHC03 溶液溶解0.01g酚紅；（2）稱取0.2g KCl

9、、0.03g KH2PO4、4g NaCl、0.175g NaHCO3、0.03gNa2HPO4.7H2O依次溶解于適量三蒸水中( 注意應(yīng)待前一種試劑完全溶解后，再溶解下一種成分)。（3） 將（1）加入（2）中；（4） 將（3）移入容量瓶中，定容至500mL；（5）分裝，10磅20分鐘高壓蒸氣滅菌，4冰箱內(nèi)保存。2. 各組練習(xí)配制30mL完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)無菌操作意識。在超凈臺內(nèi)按照無菌操作要求取27mL DMEM液，加入3 mL血清、300L雙抗，練習(xí)過濾除菌方法。注：（不寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告）準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)要求：在超凈臺內(nèi)放置好做好標(biāo)記的DMEM液、血清、雙抗（3種都可用替代品）、用過的過濾器（平時(shí)注意收集

10、）、吸管、洗耳球、燒杯及培養(yǎng)瓶等。實(shí)驗(yàn)五培養(yǎng)細(xì)胞的觀察【目的與要求】掌握倒置顯微鏡觀察貼壁型細(xì)胞的方法。【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天觀察，以便及時(shí)了解細(xì)胞的生長狀態(tài)?；罴?xì)胞對光線是透明的，光線通過活細(xì)胞時(shí)，波長和振幅幾乎沒有改變，所以用普通光學(xué)顯微鏡無法看清未經(jīng)染色的活細(xì)胞。倒置顯微鏡利用光的衍射和干涉特性，把透過標(biāo)本不同區(qū)域的光波的光程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對比，從而使標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)變得清晰。因此，體外培養(yǎng)細(xì)胞的觀察必須要用倒置顯微鏡?！酒鞑呐c試劑】 倒置顯微鏡、生長良好的細(xì)胞?！緝?nèi)容與方法】在倒置相差顯微鏡下對培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀況進(jìn)行觀察。注：（本

11、實(shí)驗(yàn)不寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告）準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)要求：準(zhǔn)備幾瓶細(xì)胞供學(xué)生練習(xí)觀察實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力檢查 【目的與要求】掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力檢查的原理和方法。【基本原理】培養(yǎng)的細(xì)胞接種合適的密度才能生長良好，細(xì)胞計(jì)數(shù)是調(diào)整細(xì)胞密度的依據(jù)。細(xì)胞活力測定是了解細(xì)胞狀態(tài)的重要手段。用臺盼藍(lán)染細(xì)胞時(shí)，由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，染料可大量進(jìn)入不能排出被染成藍(lán)色；活細(xì)胞能排出染料，不易著色?！酒鞑呐c試劑】移液器、血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片、吸管、吸耳球、dorf管、離心管、SP2/0-Ag14懸浮細(xì)胞、0.4%臺盼藍(lán)液等。【內(nèi)容與方法】1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法(1)將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板的2個(gè)小室上。

12、(2)加樣：細(xì)胞懸液吹勻后，用200l加樣槍吸出滴加在蓋片邊緣與計(jì)數(shù)板交界處，使細(xì)胞懸液進(jìn)入小室，并充滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板的間隙。(3) 用10×物鏡鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞計(jì)左側(cè)和上方者。按下式計(jì)算： 細(xì)胞數(shù)/mL4大格細(xì)胞總數(shù)/4×104 注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。2. 染色法檢查細(xì)胞活力 (1) 分別滴一滴細(xì)胞懸液和0.4%臺盼蘭染液于載玻片上，用蓋玻片角混勻。 (2) 45度蓋上蓋玻片，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。 (3) 計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）= 活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)

13、胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%（完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告）準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)要求：將本實(shí)驗(yàn)用器材、液體、待計(jì)數(shù)的細(xì)胞做好標(biāo)記放置于普通光學(xué)顯微鏡旁邊，以方便學(xué)生操作。實(shí)驗(yàn)七 細(xì)胞生長曲線的繪制【目的與要求】 掌握細(xì)胞生長曲線繪制的方法.【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞生長曲線是觀測細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標(biāo),它以培養(yǎng)時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖?！酒鞑呐c試劑】吸管、吸耳球、血球計(jì)數(shù)板、微量加樣器、96孔培養(yǎng)板、SP2/0-Ag14細(xì)胞懸液等?！緝?nèi)容與方法】1. 在超凈臺中，將濃度為1.0×104個(gè)/mL SP2/0-Ag14細(xì)胞懸液，用微量加樣器接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200µ

14、;L，接種24孔，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2從培養(yǎng)第24h開始，每24h分別于超級工作臺上吸出3孔的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算其平均值。（注意，每天取計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)將待取培養(yǎng)孔中的細(xì)胞吹打幾下，確保沉于孔底的細(xì)胞全部吸出，此過程要保證無菌操作，以免污染細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，實(shí)驗(yàn)失敗）3以細(xì)胞濃度為縱坐標(biāo)、細(xì)胞生長時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。注意：每2組或3組用一塊培養(yǎng)板。（完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告）準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)要求：將接種細(xì)胞事先計(jì)數(shù)濃度，然后預(yù)先稀釋成1.0×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，吹吸混勻后為各小組分裝一份，做好標(biāo)記放置于超凈工作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)八 細(xì)胞融合 【目的與要求】掌握聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)細(xì)胞融合的操作方法。

15、【實(shí)驗(yàn)原理】兩個(gè)或兩個(gè)以上的同種或不同種細(xì)胞在誘導(dǎo)物的作用下，細(xì)胞膜發(fā)生一定變化，融合成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的現(xiàn)象稱為細(xì)胞融合。聚乙二醇（PEG）是常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑，它可促使細(xì)胞凝結(jié)，并破壞互相接觸處的細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，使細(xì)胞膜之間發(fā)生融合，進(jìn)而細(xì)胞質(zhì)溝通，形成一個(gè)雙核或多核融合細(xì)胞。【器材與試劑】移液器、吸管、離心管、載玻片、蓋玻片、50%PEG、次甲基藍(lán)染液、Hanks液、SP2/0-Ag14細(xì)胞、 DMEM完全培養(yǎng)液等。（50%PEG的配制方法：稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化，迅速加入0.5ml預(yù)熱的Hanks液混勻制成50的PEG溶液。放入37水浴中

16、待用）?！緝?nèi)容與方法】   1將SP2/0-Ag14細(xì)胞懸液5 mL置于離心管中充分混勻，1000rpm離心5min，棄上清，再小心地吸盡殘液。用指彈法彈散細(xì)胞，在37水浴條件下吸取0.125mL 50PEG，逐滴加入離心管內(nèi)，并不斷地輕輕搖動(dòng)，整個(gè)過程約90s。然后緩慢加入2mL Hanks液以終止PEG的作用。加入0.25mL 完全培養(yǎng)液，在37水浴靜置30min。   2觀察：細(xì)胞溫育時(shí)，分別于5、15、30min取細(xì)胞懸液1滴滴在載玻片，加1滴次甲基藍(lán)染液染色混合，加上蓋玻片鏡下觀察細(xì)胞融合過程。（拍下細(xì)胞融合過程，打印附于實(shí)驗(yàn)報(bào)告）準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)要求

17、：將本實(shí)驗(yàn)用器材、液體、待融合的細(xì)胞樣品做好標(biāo)記放置于普通光學(xué)顯微鏡旁邊，以方便學(xué)生操作。實(shí)驗(yàn)九 細(xì)胞系傳代培養(yǎng) 【目的與要求】掌握細(xì)胞系傳代培養(yǎng)技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞當(dāng)密度達(dá)到鋪滿整個(gè)瓶底，且超出培養(yǎng)基的能力時(shí)，細(xì)胞生長停止或生長速度大大放緩，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。【器材與試劑】細(xì)胞培養(yǎng)瓶、吸管、吸耳球、移液器、DMEM完全培養(yǎng)基、0.125%胰蛋白酶、致密單層BHK21細(xì)胞等?！緝?nèi)容與方法】1.取一瓶生長良好的致密單層BHK21細(xì)胞，

18、傾出舊培養(yǎng)液,加入0.125%胰蛋白酶溶液1mL（覆蓋住細(xì)胞即可）輕緩漂洗培養(yǎng)物1次。2. 在細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)重新加入0.125%胰蛋白酶溶液2mL消化細(xì)胞。（細(xì)胞消化的程度可以通過倒置顯微鏡直接觀察判斷，一般以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度。也可以通過肉眼觀察，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)終止消化）3.終止消化吸去或者傾倒出消化液，拍打細(xì)胞瓶使細(xì)胞脫落，加入3 mL完全培養(yǎng)液。4.吹打分散細(xì)胞用吸管吸取培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞生長面瓶壁，使細(xì)胞脫離細(xì)胞瓶壁。吹打過程須有序進(jìn)行，即要從一邊開始到另一邊結(jié)束，尤其是器皿的邊緣地帶和四角處，確保瓶壁各處的細(xì)胞均被吹打脫離，細(xì)胞吹打

19、脫離瓶壁后，再吹打1520次后，得到細(xì)胞懸液。（吸取出1.5mL細(xì)胞懸液于離心管中，用于下一個(gè)凍存實(shí)驗(yàn)）。吹打時(shí)吹出液體的力度要適中，否則會(huì)直接損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡。5.將剩余細(xì)胞懸液接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)（預(yù)先已經(jīng)加了所需的完全培養(yǎng)液），送入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。6于培養(yǎng)的48h或72h分別觀察傳代細(xì)胞生長情況。 （拍下48h或72h時(shí)的細(xì)胞生長情況圖，打印附于實(shí)驗(yàn)報(bào)告）準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)要求：將預(yù)先已經(jīng)加了所需的完全培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶（約15mL）、本實(shí)驗(yàn)所需的其他液體做好標(biāo)記，連同所需器械（如離心管等）放入超凈工作臺內(nèi)，每一小組準(zhǔn)備一份。由于本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞還要用于凍存，因此準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)時(shí)還要在超

20、凈工作臺內(nèi)放置好凍存管以及離心管、凍存液（務(wù)必做好標(biāo)記，否則和其他液體無法區(qū)分）等細(xì)胞冷凍保存實(shí)驗(yàn)所需的物品。實(shí)驗(yàn)十 細(xì)胞冷凍保存 【目的與要求】掌握細(xì)胞凍存的操作過程【實(shí)驗(yàn)原理】凍存保存就是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70的超低溫條件）長期保存的過程。向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入甘油或DMSO等冷凍保護(hù)劑后，使冰點(diǎn)降低，在緩慢凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分子在結(jié)冰前透出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，減輕冰晶造成的細(xì)胞損傷?！酒鞑呐c試劑】移液器、凍存管、冷凍保護(hù)液（以7份DMEM、2份小牛血清與1份二甲基亞砜混合而成）、BHK21細(xì)胞懸液等?！緝?nèi)容與

21、方法】1. 將上個(gè)實(shí)驗(yàn)制備好的BHK21細(xì)胞懸液以8001000r/min離心5min，棄上清液。2. 向沉淀物中加入冷凍保護(hù)液1.5mL，輕輕吹打均勻，移入凍存管內(nèi)，擰緊管蓋。3. 在凍存小管上做標(biāo)記，包括細(xì)胞代號及凍存日期。4. 冷凍程序： 4，20min -20,20min -80過夜 次日投入液氮罐中。（本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告和細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)合起來寫）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備見細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十一細(xì)胞復(fù)蘇 【目的與要求】掌握細(xì)胞復(fù)蘇技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過程。復(fù)蘇時(shí)，一般以很快的速度升溫，12min內(nèi)恢復(fù)到常溫，這樣細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶，也不會(huì)暴露在高濃

22、度溶質(zhì)的溶液中過長時(shí)間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生?！酒鞑呐c試劑】細(xì)胞培養(yǎng)瓶（帶蓋或塞）、吸管、離心管、吸耳球、移液器、DMEM完全培養(yǎng)液等。【內(nèi)容與方法】1.調(diào)配3740的溫水，或?qū)⒑銣厮″伒臏囟日{(diào)至3740。2.從液氮中取出凍存小管，立即投入3740溫水中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全融解。要在12min內(nèi)完成。3.將細(xì)胞凍存懸液移人離心管，加入約5mL培養(yǎng)液，輕輕吹勻。4.將細(xì)胞懸液經(jīng)8001000r/min離心5min，棄上清液。5.給細(xì)胞沉淀物加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸均勻。將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。6.于培養(yǎng)的48或72小時(shí)觀察細(xì)胞生長情況。（拍下48h或72h時(shí)的細(xì)胞生長情況圖

23、，打印附于實(shí)驗(yàn)報(bào)告）準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)要求：為每組準(zhǔn)備一個(gè)離心管（里面加入5mL培養(yǎng)液）、一個(gè)培養(yǎng)瓶（里面加入約10mL完全培養(yǎng)液）做好標(biāo)記放入超凈工作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)十二細(xì)胞原代培養(yǎng)酶消化培養(yǎng)【目的與要求】掌握組織取材、剪切、酶消化分離細(xì)胞的方法【實(shí)驗(yàn)原理】酶消化原代細(xì)胞培養(yǎng)是將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)酶消化（常用胰蛋白酶）分散成單細(xì)胞，置于合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞生長和繁殖。 【器材與試劑】細(xì)胞培養(yǎng)瓶（帶蓋或塞）、青霉素瓶（帶塞）、100目不銹鋼篩網(wǎng)、吸管、眼科剪、眼科鑷、離心管（10mL）、燒杯、培養(yǎng)皿、DMEM完全培養(yǎng)基、0.125%胰蛋白酶、D-Hanks液、10日齡雞胚等。【內(nèi)容與方法

24、】（1）用 75% 乙醇消毒雞胚, 氣室端向上放于小燒杯內(nèi)。（2）用無菌鑷打破卵殼, 剝離卵殼直到氣囊的邊緣。（3）重新消毒鑷子(浸入乙醇, 燒干乙醇, 于無菌的Hanks液中冷卻)后用鑷子剝離白色的殼膜，顯露下面的絨毛尿囊膜及血管。（4）用彎鑷子刺破絨毛尿囊膜, 輕輕夾住頭部下方, 提出胚胎, 不要完全閉合鑷子，避免頸部受損。將雞胚放入平皿中.（5）去除頭部及內(nèi)臟等，保留實(shí)驗(yàn)所需組織，用D-Hanks液洗滌3次。將洗滌后的組織分成2部分，一半用于酶消化，一半用于組織塊培養(yǎng)。（6）將用于酶消化的組織轉(zhuǎn)移至青霉素瓶（帶塞）中，剪切成0.5mm3左右的小塊，可再用D-Hanks液洗一次。（7）視組

25、織塊量加入56倍的0.125%胰蛋白酶，37，消化，每隔5min振蕩一次，使細(xì)胞分離。直至組織塊發(fā)白，出現(xiàn)絮狀，加入35mL DMEM完全培養(yǎng)液終止消化作用。（8） 靜置510min，使未分散的組織塊下沉，盡量多地棄去上清液，再加入5mL DMEM完全培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打。（9）用100目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞至離心管中， 1000r/min，離心10min，棄上清液。（10）加入培養(yǎng)液l2 mL（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。（11） 將細(xì)胞調(diào)整到5.0×105個(gè)/mL1.0×106個(gè)/mL左右，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。（12）分別于48h或72h觀察細(xì)胞生長情況。（實(shí)驗(yàn)報(bào)告和下

26、一個(gè)實(shí)驗(yàn)一起寫）實(shí)驗(yàn)十三細(xì)胞原代培養(yǎng)植塊培養(yǎng)法【目的與要求】掌握細(xì)胞植塊培養(yǎng)的方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】植塊培養(yǎng)是比較簡單的培養(yǎng)方法，其技術(shù)要點(diǎn)就是將從動(dòng)物體內(nèi)所取得的組織切割成一定大小的植塊，再將植塊接種到培養(yǎng)皿內(nèi)，加入培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)瓶皿送入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)?！酒鞑呐c試劑】略【內(nèi)容與方法】（1）將用于組織塊培養(yǎng)的另一半雞胚組織剪切成1mm3左右的小塊。（2）將剪切好的組織小塊送入培養(yǎng)瓶中，均勻擺置在培養(yǎng)瓶生長面，每小塊間距5mm左右。（4）組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓生長面朝上，向瓶內(nèi)注入10mL完全培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶傾斜放置在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。（5）放置6-12h待組織小塊貼附后

27、，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)。此過程動(dòng)作要輕巧，讓液體緩緩覆蓋組織小塊。嚴(yán)禁動(dòng)作過快使液體產(chǎn)生沖力將粘貼的組織塊漂起而造成原代培養(yǎng)失敗。（6）分別于48h或72h觀察雞胚細(xì)胞的生長情況 （將以上2個(gè)實(shí)驗(yàn)合寫成一個(gè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告，拍下48h或72h時(shí)的細(xì)胞生長情況圖，打印附于實(shí)驗(yàn)報(bào)告）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備要求：為每一實(shí)驗(yàn)小組分裝實(shí)驗(yàn)所需的雞胚、各種試劑，并做好標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)時(shí)分發(fā)到各實(shí)驗(yàn)小組。為每一小組備好足夠量的實(shí)驗(yàn)所需的各種器械。實(shí)驗(yàn)十四 原代細(xì)胞首次傳代培養(yǎng) 【目的與要求】掌握原代細(xì)胞的首次傳代技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】原代細(xì)胞的首次傳代是建立細(xì)胞系關(guān)鍵的時(shí)期。細(xì)胞沒有生長到足以覆蓋瓶底大部分表面以前不要傳代。首次

28、傳代細(xì)胞數(shù)量要多?！酒鞑呐c試劑】細(xì)胞培養(yǎng)瓶、吸管、吸耳球、移液器、DMEM完全培養(yǎng)基、0.125%胰蛋白酶等。實(shí)驗(yàn)材料：各組上次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的致密單層雞胚成纖維細(xì)胞?！緝?nèi)容與方法】1.取一瓶生長良好的致密單層雞胚成纖維細(xì)胞，傾出舊培養(yǎng)液,加入0.125%胰蛋白酶溶液1mL（覆蓋住細(xì)胞即可）輕緩漂洗培養(yǎng)物1次。2. 在細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)重新加入0.125%胰蛋白酶溶液2mL消化細(xì)胞。（細(xì)胞消化的程度可以通過倒置顯微鏡直接觀察判斷，一般以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度。也可以通過肉眼觀察，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)終止消化）3.終止消化吸去或者傾倒出消化液，拍打細(xì)胞瓶使細(xì)胞脫落，加入3 mL完全培養(yǎng)液。4.吹打分散細(xì)胞用吸管吸取培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞生長面瓶壁，使細(xì)胞脫離細(xì)胞瓶壁。吹打過程須有序進(jìn)行，即要從一邊開始到另一邊結(jié)束，尤其是器皿的邊緣地帶和四角處，確保瓶