細(xì)胞化學(xué)染色

1、細(xì) 胞 化 學(xué) 染 色細(xì)胞化學(xué)染色是將形態(tài)和功能相結(jié)合的細(xì)胞科學(xué)。它是在保持完整的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的前提下, 運用化學(xué)反應(yīng)將被檢細(xì)胞內(nèi)的各類化學(xué)成分和細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生理活性物質(zhì)原位地顯示。因而對于探索細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分、生理功能、新陳代謝及細(xì)胞生理和病理改變有著重要意義。血液細(xì)胞化學(xué)染色的范圍一般可分為：蛋白質(zhì)類（氨基酸、酶 )、核酸類、多糖類、脂類、鹽類或金屬類, 采用的方法通常為化學(xué)結(jié)合和物理溶解及酶-底物反應(yīng)。臨床評價 :1. 細(xì)胞化學(xué)染色的開展 ,已有數(shù)十年的歷史。其在結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上對各類白血病的確診，對許多血液疾病鑒別診斷中的幫助，對各種良、惡性血液系統(tǒng)疾病療效和預(yù)后估計提供一定

2、的信息。2. 血液系統(tǒng)各種惡性疾病，特別是急性白血病，因其多為早期分化較差的病理細(xì)胞增殖, 客觀上存在著形態(tài)變異、畸形發(fā)育，即使是有經(jīng)驗的檢驗人員僅憑細(xì)胞形態(tài)也難以避免錯誤診斷的發(fā)生。如將細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞化學(xué)染色相結(jié)合， 能提高急性白血病的診斷和較正確地對其分型及亞型分型，即為急性白血病FAB分型。3. 近年來，由于細(xì)胞免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等迅速發(fā)展，進一步推動了細(xì)胞化學(xué)染色這一領(lǐng)域的進展，并出現(xiàn)了細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞超微化學(xué)染色等更新、更準(zhǔn)確的檢驗方法與手段，對探討各類血液疾病發(fā)病原理和觀察治療反應(yīng)及預(yù)后起了極其重要的作用。如將細(xì)胞免疫化學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)

3、這三者與細(xì)胞化學(xué)染色及細(xì)胞形態(tài)學(xué)相結(jié)合，對各種白血病進行分型，即成為白血病的MICM分型診斷。4. 細(xì)胞化學(xué)染色通常應(yīng)用在各種血液系統(tǒng)疾病特別是對各種急性白血病的診斷與鑒別診斷中。但白血病細(xì)胞因其呈高度的異質(zhì)性和多態(tài)性，有時即使是同一類型的白血病也可在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果、細(xì)胞免疫表型及分子生物學(xué)等方面存在較大的差異。所以對各類型白血病作一套較完整的細(xì)胞化學(xué)是補充了單憑形態(tài)對細(xì)胞辨認(rèn)的不足。因此我們在實際工作中若要對各類型白血病作出比較準(zhǔn)確的診斷與鑒別診斷，應(yīng)盡可能采用多項細(xì)胞化學(xué)染色或雙（多）重染色。細(xì)胞化學(xué)染色方法分門別類有許多種，結(jié)果的顯示也不盡相同，有時即使檢測同一物質(zhì)，因采用的

4、方法不同其結(jié)果有可能存在一定的偏差，會造成科室間（甚至同科室不同操作人員間）對同一份標(biāo)本作出不同的診斷。所以我們應(yīng)注意選擇結(jié)果穩(wěn)定、操作簡便（操作步驟越多，出現(xiàn)的誤差幾率就越大）、陽性顯示明顯的方法或標(biāo)準(zhǔn)試劑盒。如果條件允許可與細(xì)胞免疫化學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等相結(jié)合,使細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)揮最大、最準(zhǔn)確的作用。一 過氧化物酶染色peroxidase ,(POX)原理：在血液和骨髓細(xì)胞中，粒細(xì)胞系和單核細(xì)胞系的嗜苯氨藍(lán)顆粒 (A顆粒)內(nèi)的溶酶體中存在有過氧化物酶（POX）。通過此酶氧化過氧化氫，釋放出單原子氧，后者氧化3-3二氨基聯(lián)苯胺，使之變成棕黑色顆粒狀沉淀物，定位于酶活力所在處。由于各種細(xì)

5、胞內(nèi)過氧化物酶（POX）的活力不同，其顆粒大小與色澤深淺也有所不等。此酶的活性與溶酶體的數(shù)量有關(guān)，而與嗜苯氨藍(lán)顆粒（A）顆粒的多少無關(guān)。淋巴細(xì)胞質(zhì)嗜苯氨藍(lán)顆粒中不存在溶酶體，所以過氧化物酶染色呈陰性反應(yīng)，正常人群中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞呈陽性反應(yīng)。淋巴細(xì)胞、巨核細(xì)胞、紅細(xì)胞、漿細(xì)胞等均呈陰性反應(yīng)。正常細(xì)胞反應(yīng):1. 粒細(xì)胞系-各階段中性粒細(xì)胞（少數(shù)原粒除外）可呈顆粒狀陽性或強陽性。定位于胞質(zhì)內(nèi)。嗜酸性粒細(xì)胞可呈均勻粗大顆粒狀陽性。定位于胞質(zhì)內(nèi)。2. 單核細(xì)胞系-成熟單核和幼稚單核及部分原始單核(分化較好)可呈彌散細(xì)顆粒狀陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。3. 紅細(xì)胞系、淋巴細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系、漿細(xì)

6、胞系-均呈陰性。病理變化：1.酶活性增高可見于再生障礙性貧血、急性粒細(xì)胞性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、放射病、嗜堿粒細(xì)胞在慢性粒細(xì)胞性白血病時可出現(xiàn)陽性。2. 酶活性減低可見于某些腫瘤、MDS、鏈球菌感染、風(fēng)濕熱等。3. 酶活性缺乏可見于：a.(MPO)髓過氧化物酶缺乏引起中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞POX呈陰性,僅在涂片中見少數(shù)早幼粒細(xì)胞呈弱陽性反應(yīng)。b.乳過氧化物酶缺乏引起的嗜酸粒細(xì)胞POX呈陰性。臨床評價:1. 通常將其染色陽性率3%作為淋與非淋的分界標(biāo)準(zhǔn)。但需注意在淋巴細(xì)胞白血病時原始粒和單核細(xì)胞有時也會超過3%, 此時應(yīng)慎重考慮, 結(jié)合形態(tài)反復(fù)觀察。2. 若POX染色陽性且強度較高可結(jié)合細(xì)

7、胞化學(xué)染色、細(xì)胞免疫表型檢測, 遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢測對各種急性髓性白血病進行分型或亞型間的區(qū)別, 特別有助于M1與M5a、M2b與M3b及M4型亞型的鑒別。3. 若POX染色呈陰性反應(yīng), 必須結(jié)合其它細(xì)胞化學(xué)染色、細(xì)胞免疫表型, 遺傳學(xué)和分子生物學(xué), 來加以區(qū)分出淋巴系、非淋巴系、雙表型、干細(xì)胞型等惡性增生。并對Mo與L3、M5a與L2、干細(xì)胞白血病與L3等進行診斷及鑒別診斷。操作步驟:將新鮮涂片滴加POXI液數(shù)滴（覆蓋血膜為宜），室溫放置1分鐘，勿沖洗即滴加POXII液數(shù)滴(與液等量)，可用洗耳球輕輕將二液充分混勻后置室溫5分鐘，隨后用流水沖洗35分鐘。再滴加95%乙醇脫色約23分鐘，至涂

8、片呈淡紅色。水洗后以瑞氏染色液復(fù)染1015分鐘，水洗待涂片干燥后鏡檢并觀察結(jié)果。結(jié)果顯示：陰性 （）胞質(zhì)內(nèi)無色。陽性 （+）胞質(zhì)中見棕黑色顆粒，呈局灶性分布。（+）胞質(zhì)中見粗大、密集、分布較廣的藍(lán)黑色顆粒。（+）胞質(zhì)中幾乎布滿大量粗大、成團塊、藍(lán)黑色顆粒。（+） 胞質(zhì)中充滿粗大團塊狀藍(lán)黑色顆粒并可覆蓋于胞核上。位于胞質(zhì)。注意事項:1. 每次操作均須取正常標(biāo)本做陰、陽性同步對照。2. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標(biāo)本被污染 取干凈玻片從新采集標(biāo)本 標(biāo)本放置時間過久

9、 從新采集標(biāo)本 標(biāo)本沾遇其他化學(xué)物質(zhì)特別是甲醇、過碘酸、鹽酸等 采用未被污染的標(biāo)本重新染色 試劑滴加量太少或滴加后沿載玻片邊沿流失 可重新滴加試劑試劑啟用后保存不當(dāng)特別是液 換新試劑或液 使用了加有抗凝劑的標(biāo)本 從新采集標(biāo)本 染色背景太復(fù)雜采用了溶血的標(biāo)本 采用未溶血的標(biāo)本重新染色 推制標(biāo)本時用力過猛造成細(xì)胞破裂 從新采集標(biāo)本 部分白血病細(xì)胞易破碎特別是M3型白血病細(xì)胞 無法去除 染色及復(fù)染后水洗時間不夠或沖洗 通常水洗時間為23分鐘而且 方法不當(dāng) 不能先倒掉復(fù)染液，須連染液一起沖洗 二、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色Neutrophil alkaline phosphatase ,(NAP)原 理

10、：中性粒細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶（NAP）在堿性環(huán)境下，水解-磷酸萘酚鈉，產(chǎn)生-萘酚。后者與重氮劑偶聯(lián)形成紅色沉淀物，沉淀物的顯色深淺與NAP活性成正比。正常血細(xì)胞反應(yīng) :中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶是中性粒細(xì)胞中的特異性顆粒 (S 顆粒 )所釋放的一種酶, 存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的三級顆粒中呈不規(guī)則形的管狀結(jié)構(gòu), 該酶的活力與積分受到體內(nèi)許多因素的影響。如中性粒細(xì)胞的成熟程度、HbF、內(nèi)分泌功能等均能使NAP的積分產(chǎn)生一定的差異,但正常人群中性粒細(xì)胞的陽性程度一般很少達(dá)到3分, 絕對達(dá)不到4分。其酶活力的正常范圍通常為：細(xì)胞陽性率 ；256個/100個成熟中性粒細(xì)胞； 陽性細(xì)胞積分：480個/100個中性粒細(xì)胞病

11、理變化：NAP 積分增高：1. 細(xì)菌感染,凡革蘭陽性球菌感染、NAP活力顯著升高。2. 真性紅細(xì)胞增多癥,NAP活力持續(xù)增加,且治療后未見能恢復(fù)正常。3. 再生障礙性貧血,NAP活力持續(xù)增加,經(jīng)治療緩解時可有下降趨勢。4. 類白血病,由化濃性球菌引起的類白反應(yīng),NAP活力明顯升高。5. 急性淋巴細(xì)胞性白血病可見NAP中度增加,而多發(fā)性骨髓瘤則活力顯著提高。6. 其它類型如燒傷、中毒、手術(shù)后、外傷等均可使NAP活力升高。NAP 積分降低：1. 粒細(xì)胞缺乏癥、脾亢等疾病時NAP活力下降。2. 感染, 由革蘭陰性桿菌、結(jié)核、病毒、立克次體病等NAP活力可明顯或重度減低。3. 白血病,單核細(xì)胞和粒細(xì)胞

12、系統(tǒng)白血病,特別是慢性粒細(xì)胞白血病 NAP活力明顯減低甚至消失。臨床評價:若配合染色體檢查及分子生物學(xué)診斷技術(shù)可提高慢性粒細(xì)胞白血病的診斷；配合酸溶血試驗,尿含鐵血黃素試驗可提高PNH的診斷及有利于PNH與再生障礙性貧血的鑒別；配合其它細(xì)胞化學(xué)染色可輔助鑒別急性淋巴細(xì)胞性白血病與急性非淋巴細(xì)胞性白血病。操作步驟：將新鮮涂片滴加固定液（4）30秒，水洗待干備用。將NAP液置入NAP液混合成為基質(zhì)液(可先吸取少量NAP液置入NAP液內(nèi)，待NAP液充分溶解后再一起置入NAP液內(nèi))。將涂片置入后，37放置30分鐘。連染色缸流水沖洗數(shù)分鐘，取出待干。蘇木素復(fù)染12分鐘，水洗，待干，鏡檢。結(jié)果顯示：陰性

13、（）0分：胞質(zhì)內(nèi)無色。陽性 （+）1分：胞質(zhì)見淺紅色，無顆粒或有少量細(xì)小顆粒但小于胞質(zhì)1/4面積。（+）2分：胞質(zhì)見紅色，有較粗紅色顆粒但小于胞質(zhì)1/2面積。（+） 3分：胞質(zhì)見粗大紅色顆粒，可達(dá)胞質(zhì)面積3/4以上。（+）4分：胞質(zhì)見粗大深紅色顆粒，達(dá)胞質(zhì)全部面積甚至可掩蓋于胞核上。注意事項:1. 年齡變化：新生兒NAP活性較高,以后逐漸下降。2. 應(yīng)激狀態(tài)：緊張、恐懼、激烈運動等NAP積分可增高。3. 妊娠和月經(jīng)周期的變化也可使NAP的活力有所差異。4.藥物所致,特別是激素類如腎上腺皮質(zhì)激素、雌激素等均可使NAP積分增高。 5. 每次實驗均設(shè)陰、陽性標(biāo)本對照。6. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定

14、，盡量減少室內(nèi)誤差。7. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位, 最好選擇體尾交接處,有時不同部位其陽性強度可相差二個(+)以上。尤其作慢粒隨訪病人積分計算時需特別注意。常見問題與結(jié)局方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標(biāo)本被污染 取干凈玻片從新采集標(biāo)本 標(biāo)本放置時間過久且未固定 從新采集標(biāo)本并立即固定，在三天內(nèi)檢測完畢固定液使用時大于4另取標(biāo)本重新用4固定液固定 采用了加有抗凝劑的標(biāo)本從新采集標(biāo)本 標(biāo)本沾遇其他化學(xué)物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標(biāo)本重新染色 試劑配制時液未完全置入液內(nèi)或未完全溶解 需取新試劑從新配制 試劑配制后未及時使用 需取新

15、試劑從新配制 孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景太復(fù)雜背景細(xì)胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標(biāo)本重新染色 染色后沖洗方法不當(dāng)不能先倒掉染液，應(yīng)連染色缸置流水沖洗染液，23分鐘復(fù)染后水洗時間不夠復(fù)染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復(fù)染液一起沖洗 三、細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶染色acid phosphatase in cells ,(ACP)原理:酸性磷酸酶廣泛存在于人體組織細(xì)胞內(nèi), 其最適pH為4.55.5左右 , 酸性磷酸酶通常存在于溶酶體內(nèi), 其同工酶有七種。血細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶（ACP）能水解磷酸萘酚AS-BI，釋放出萘酚AS-BI，后者與偶氮劑偶聯(lián)形成紅色沉淀物。沉淀物的

16、顯色深淺與ACP活性成正比。正常血細(xì)胞反應(yīng) : 粒細(xì)胞系-部分成熟粒細(xì)胞可呈彌散狀弱陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。 淋巴細(xì)胞系- 部分T-淋巴細(xì)胞可呈粗顆?；蛐K狀陽性,定位于胞質(zhì)內(nèi)。 部分B-淋巴細(xì)胞可呈細(xì)顆粒或彌散狀陽性,定位于胞質(zhì)內(nèi)。 單核細(xì)胞系-部分單核細(xì)胞可呈彌散狀弱陽性,定位于胞質(zhì)內(nèi)。 巨核細(xì)胞系-巨核細(xì)胞和血小板可呈彌散狀弱陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。 網(wǎng)狀細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、組織噬堿性細(xì)胞可呈彌散和/或顆粒狀陽性,定位于胞質(zhì)內(nèi)。 紅細(xì)胞系-基本呈陰性. 病理變化:酸性磷酸酶在T-淋巴細(xì)胞異常增多時都具較強的活性, 特別在急性T-淋巴細(xì)胞白血病時最為顯著, 但對L(+) 酒石酸敏感受其抑制, 在B

17、- 淋巴細(xì)胞異常增生時, 多數(shù)為陰性或弱陽性反應(yīng)。而多毛細(xì)胞性白血病可呈較強的陽性反應(yīng), 且因含獨特的同工酶5,不被 L(+) 酒石酸所抑制。所以酸性磷酸酶對多毛細(xì)胞白血病的診斷具重要價值。在急性非淋巴細(xì)胞白血病中, 單核細(xì)胞系統(tǒng)反應(yīng)比粒系細(xì)胞系統(tǒng)較強。多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、漿細(xì)胞均可呈強陽性反應(yīng)。另對高-雪細(xì)胞和尼曼-匹克細(xì)胞的鑒別有較重要價，通常高-雪細(xì)胞呈強陽性反應(yīng)而尼曼-匹克細(xì)胞呈陰性反氣應(yīng)。臨床評價 :1. 結(jié)合電鏡超微結(jié)構(gòu)檢查, 可對多毛細(xì)胞性白血病作出診斷。2. 結(jié)合細(xì)胞免疫表型檢測, 有助于區(qū)別各種B-細(xì)胞克隆增生性疾病 , 如慢淋與毛白、B-ALL與毛白。3. 結(jié)合其它細(xì)胞化學(xué)染

18、色,有助于對急性粒-單細(xì)胞白血病亞型的分類。操作步驟:將新鮮涂片滴加固定液58滴 ，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗備用。將ACP液、液加入ACP液中混勻(可先吸取少量ACP液分別置入ACP、液內(nèi)，待ACP、液充分溶解后再一起置入ACP液內(nèi))成為基質(zhì)液。再將涂片置入后，37放置90分鐘，流水沖洗數(shù)分鐘。蘇木素復(fù)染12分鐘，水洗待干，鏡檢。結(jié)果顯示：陰性 （）胞質(zhì)無沉淀物（無色）陽性 （+）胞質(zhì)見淺紅色或有少量細(xì)小顆粒。（+）胞質(zhì)見紅色或有較粗紅色顆粒但小于胞質(zhì)1/2面積。（+）胞質(zhì)見粗大紅色顆粒，可達(dá)胞質(zhì)面積3/4以上。（+） 胞質(zhì)見粗大深紅色顆粒，達(dá)胞質(zhì)全部面積。注意事項:1. 由于含酸性磷酸

19、酶的血液細(xì)胞有許多, 且各種細(xì)胞所含ACP同工酶不同, 即同一基質(zhì)可有陽性程度的差異, 在同一類細(xì)胞中可因基質(zhì)不同而使陽性結(jié)果存在明顯差異, 特別在不同的實驗室之間龍為突出。2. 在每次操作時均應(yīng)設(shè)正常標(biāo)本陰、陽性對照。3. ACP染色結(jié)果以彌散狀陽性出現(xiàn)的細(xì)胞較多,如為弱陽性反應(yīng), 在復(fù)染時應(yīng)注意在涂片縱向復(fù)染一半, 另一半不復(fù)染以利弱陽性的觀察。4. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，盡量減少室內(nèi)誤差。5. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位,最好選擇體尾交接處,有時不同部位其陽性強度可相差二個(+)以上。作L-酒石酸抑制實驗時需特別注意。 常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試

20、劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標(biāo)本被污染 取干凈玻片從新采集標(biāo)本 標(biāo)本放置時間過久且未固定 從新采集標(biāo)本并立即固定，在三天內(nèi)檢測完畢固定液使用時大于4另取標(biāo)本重新用4固定液固定 采用了加有抗凝劑的標(biāo)本從新采集標(biāo)本 標(biāo)本沾遇其他化學(xué)物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標(biāo)本重新染色 試劑配制時 、 液未完全置入液內(nèi)或未完全溶解 需取新試劑從新配制 試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制 孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景太復(fù)雜背景細(xì)胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標(biāo)本重新染色 染色后沖洗方法不當(dāng)不能先倒掉染液，應(yīng)連染色缸置流水沖洗染液，23分鐘復(fù)染后水洗時間不夠

21、復(fù)染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復(fù)染液一起沖洗 四、氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色naphthol-AS-D,chloracetate esterase(AS-DNCE)原理:一般認(rèn)為, 氯化醋酸萘酚酯酶是粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞的標(biāo)志酶, 其主要存在于粒細(xì)胞(包括分化較好的原粒細(xì)胞)的溶酶體上, 此酶與過氧化物酶在中性粒細(xì)胞中均呈陽性反應(yīng)，但此酶形成的產(chǎn)物比 POX 更為特異。血細(xì)胞內(nèi)的氯化醋酸AS-D萘酚酯酶(AS-DNCE)將氯化醋酸AS-D萘酚水解 ,產(chǎn)生萘酚AS-D，后者與重氮劑偶聯(lián)形成紅色沉淀物。沉淀物的顯色深淺與AS-DNCE活性成正比。 正常細(xì)胞反應(yīng) : 粒細(xì)胞系-中性粒細(xì)胞(除原粒

22、細(xì)胞外)均可呈陽性或強陽性,且酶活性并不隨細(xì)胞成熟而增強，定位于胞漿內(nèi)。嗜酸和嗜堿粒細(xì)胞為陰性和弱陽性，定位于胞質(zhì)內(nèi)。 2. 肥大細(xì)胞有時可呈陽性反應(yīng)，定位于胞質(zhì)內(nèi)。3. 紅細(xì)胞系、淋巴細(xì)胞系、單核細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系、漿細(xì)胞系均呈陰性。臨床評價:1. 氯化醋酸萘酚酯酶亦稱為粒系細(xì)胞特異性酯酶, 如與細(xì)胞免疫表型檢測相結(jié)合, 對AML分型具有很大的價值,特別是結(jié)合CD13、CD33、MPO 等單克隆檢測結(jié)果, 對AML-M0的診斷有極大的幫助。2. 如將氯化醋酸萘酚酯酶染色與-丁酸萘酚酯酶染色在同一標(biāo)本進行雙脂染色、其對AML- M4亞型分析非常有價值。因氯化醋酸萘酚酯酶僅為粒細(xì)胞陽性, 而-丁

23、酸萘酚酯酶可視作單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的標(biāo)志酶。操作步驟：將新鮮涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗。先將AS-DNCE液和液置入AS-DNCE液中溶解混和(可先吸取少量AS-DNCE液分別置入AS-DNCE、液內(nèi)，待AS-DNCE、液充分溶解后再一起置入AS-DNCE液內(nèi))成為基質(zhì)液。將涂片置入后，37放置30分鐘，連缸流水沖洗35分鐘。蘇木素復(fù)染12分鐘，水洗待干，鏡檢。結(jié)果顯示：陰性 （）胞質(zhì)無沉淀物（無色）陽性 （+）胞質(zhì)見淡紅色，無顆?；蛴猩倭考?xì)小顆粒。（+）胞質(zhì)見鮮紅色，有較粗紅色顆粒但小于胞質(zhì)1/2面積。（+） 胞質(zhì)見粗大深紅色顆粒，可達(dá)胞質(zhì)面積3/4以上。（+）胞質(zhì)

24、見粗大紅紫色顆粒，達(dá)胞質(zhì)全部面積甚至可掩蓋于胞核上。注意事項:1.此酶主要以定性為主，而陽性強度僅作為參考。因為酶的活力并不隨細(xì)胞成熟而增加。2.標(biāo)本必須新鮮, 取材后如無法及時染色可先行固定。3.每次操作均須取正常標(biāo)本做陰、陽性同步對照。4. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。5. 氯化醋酸萘酚酯酶染色與-丁酸萘酚酯酶染色在同一標(biāo)本進行雙脂染色須向公司另購雙酯酶染色專用試劑,用常規(guī)染色試劑無法分別陽性結(jié)果。常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標(biāo)本被污染 取干凈玻片從新采集標(biāo)本 標(biāo)本放置時間過久且未固定

25、 從新采集標(biāo)本并立即固定，在三天內(nèi)檢測完畢固定液使用時大于4另取標(biāo)本重新用4固定液固定 采用了加有抗凝劑的標(biāo)本從新采集標(biāo)本 標(biāo)本沾遇其他化學(xué)物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標(biāo)本重新染色 試劑配制時 、 液未完全置入液內(nèi)或未完全溶解 需取新試劑從新配制 試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制 孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景太復(fù)雜背景細(xì)胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標(biāo)本重新染色 染色后沖洗方法不當(dāng)不能先倒掉染液，應(yīng)連染色缸置流水沖洗染液，23分鐘復(fù)染后水洗時間不夠復(fù)染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復(fù)染液一起沖洗 五、-醋酸荼酚酯酶染色(-naphthol ace

26、tate esterase,-NAE)、原理：血細(xì)胞內(nèi)的-醋酸萘酚酯酶（-NAE）將基質(zhì)液中的-醋酸萘酚酯水解，釋放出-萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)形成灰黑色沉淀物。沉淀物的顯色深淺與- NAE活性成正比。正常細(xì)胞陽性反應(yīng):1.粒細(xì)胞系-少數(shù)中晚幼?？沙蕪浬钊蹶栃? 定位于胞質(zhì)內(nèi)。2.單核細(xì)胞系-成熟單核和幼稚單核及部分原始單核(分化較好)可呈不同程度陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。3.紅細(xì)胞系-部分中晚幼紅可呈弱陽性，定位于胞質(zhì)內(nèi)。4.巨核細(xì)胞系-巨核細(xì)胞和血小板可呈弱陽性或陽性，定位于胞質(zhì)內(nèi)。5.淋巴細(xì)胞系部分淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞可呈弱陽性，定位于胞質(zhì)內(nèi)。6.吞噬細(xì)胞-可呈強陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。臨床評價：

27、1.-醋酸荼酚酯酶染色屬臨床上常用的非特異性醋酶染色之一。此酶在單核細(xì)胞、吞噬細(xì)胞中含量較多且多數(shù)受到氟化納(NaF)抑制；粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、部分幼紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板等含量較少。非特異性酯酶由于具有較多的同工酶，且不同種類的細(xì)胞內(nèi)存有的同工酶也不盡相同，所以此類酶除了在單核-巨噬系統(tǒng)反應(yīng)較強烈以外，其它細(xì)胞系統(tǒng)也可呈現(xiàn)出不同程度的陽性，所以對細(xì)胞中非特異性酶酶如能組合檢測比單一檢測更具價值和意義。非特異性酯酶染色的主要意義在于結(jié)合細(xì)胞形態(tài)，結(jié)合其他細(xì)胞化學(xué)染色，為臨床急性非淋巴細(xì)胞性白血病的分型和亞型確定提供重要的依據(jù)。2. -醋酸荼酚酯酶因主要存在于單核細(xì)胞中，且為同工酶4、5，而中性

28、粒細(xì)胞含有的同工酶為1、2、7、9，由于一定濃度的氟化鈉能完全抑制酯酶3、5、6，此特點在對急性髓性白血病中M2、M4、M5等分型和亞型分類有一定參考價值。另由于巨核細(xì)胞此酶也可呈陽性反應(yīng), 如結(jié)合酸性磷酸酶染色(ACP)和免疫表型檢測, 可對AML-M7作出診斷。3. 非特異性醋酶染色若結(jié)合POX染色和PAS染色(雙酶染色)來綜合判斷結(jié)果，特別是如能將POX 染色與-醋酸荼酚酯酶染色聯(lián)合顯示于一張標(biāo)本片上，這比分別染色效果要更好，對M4的分型尤為突出。4. 將AS-DNCE染色與-醋酸荼酚酯酶染色同顯示于一張標(biāo)本片上，即雙醋染色，可使單核細(xì)胞和粒細(xì)胞系分辨的更為清楚, 并且能發(fā)現(xiàn)在同一個細(xì)胞

29、上同時存在二種酯酶呈陽性反應(yīng), 稱酯酶雙表現(xiàn)型細(xì)胞，為M4的診斷與分型提供了有力依據(jù)。操作步驟：將新鮮涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗。先將-NAE液和液置入-NAE液中溶解混和(可先吸取少量-NAE液分別置入-NAE、液內(nèi)，待-NAE、液充分溶解后再一起置入-NAE液內(nèi))成為基質(zhì)液。將涂片置入后，37放置30分鐘，連缸流水沖洗35分鐘。蘇木素復(fù)染12分鐘，水洗待干，鏡檢。NaF抑制試驗:將新鮮涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗。先將-NAE液和液置入-NAE液中溶解混和(可先吸取少量-NAE液分別置入-NAE、液內(nèi)，待-NAE、液充分溶解后再一起置入-N

30、AE液內(nèi))，再加入NaF一瓶（訂貨時可向公司要求配置）成為基質(zhì)液。將涂片置入后，37放置30分鐘，連缸流水沖洗35分鐘。蘇木素復(fù)染12分鐘，水洗待干，鏡檢結(jié)果顯示：陰性 （）胞質(zhì)無沉淀物（無色）陽性 （+）胞質(zhì)見淺灰色，無顆?；蛴猩倭考?xì)小顆粒。（+）胞質(zhì)見深灰色，有較粗灰黑色顆粒但小于胞質(zhì)1/2面積。（+）胞質(zhì)見粗大黑色顆粒，可達(dá)胞質(zhì)面積3/4以上。（+） 胞質(zhì)見粗大深黑色顆粒，達(dá)胞質(zhì)全部面積甚至可掩蓋于胞核上。注意事項：1. 酶的活性隨標(biāo)本采集后的時間而逐步下降，如無法及時染色，應(yīng)先固定否則將影響陽性結(jié)果。2. 涂片固定時滴加固定液要迅速一次蓋滿血膜，反復(fù)滴加可造成染色背景深淺不一。影響結(jié)果

31、觀察。3. 每次操作均須取正常標(biāo)本做陰、陽性同步對照。 以防引起背景污染，沖洗困難，特別在冬天，易使涂片表面產(chǎn)生脂質(zhì)沉淀從而影響結(jié)果觀察。 5. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。6. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位,有時不同部位其陽性強度可相差二個(+)以上。作NaF抑制率計算時需特別注意 常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標(biāo)本被污染 取干凈玻片從新采集標(biāo)本 標(biāo)本放置時間過久且未固定 從新采集標(biāo)本并立即固定，在三天內(nèi)檢測完畢固定液使用時大于4另取標(biāo)本重新用4固定液固定 采用了加有抗凝劑的標(biāo)本從新采集標(biāo)本

32、 標(biāo)本沾遇其他化學(xué)物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標(biāo)本重新染色 試劑配制時 、 液未完全置入液內(nèi)或未完全溶解 需取新試劑從新配制 試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制 孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景太復(fù)雜背景細(xì)胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標(biāo)本重新染色 染色后沖洗方法不當(dāng)不能先倒掉染液，應(yīng)連染色缸置流水沖洗染液，23分鐘復(fù)染后水洗時間不夠復(fù)染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復(fù)染液一起沖洗 六、-丁酸萘酚酯酶染色(-naphthol butyrase esterase-NBE)原理:血細(xì)胞內(nèi)的-丁酸萘酚酯酶（-NBE）將基質(zhì)液中的-丁酸萘酚酯水解，釋放出-萘酚

33、，后者與重氮鹽偶聯(lián)形成棕褐色沉淀物。沉淀物的顯色深淺與-NBE活性成正比。正常細(xì)胞陽性反應(yīng):1.粒細(xì)胞系-個別成熟中性粒細(xì)胞可呈彌散狀弱陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。2.單核細(xì)胞系-成熟單核和幼稚單核及部分原始單核(分化較好)可呈不同程度陽性或強陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)。3.吞噬細(xì)胞-可呈陽性或強陽性, 定位于胞質(zhì)內(nèi)4.紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系、淋巴細(xì)胞系、漿細(xì)胞均呈陰性。臨床評價：1.-丁酸荼酚酯酶染色屬臨床上常用的非特異性醋酶染色之一。此酶在單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中反應(yīng)強烈，同時此反應(yīng)也能被NaF所抑制,而粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、部分幼紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板等含量很少。所以-丁酸荼酚酯酶亦被視作單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)

34、所特有的標(biāo)志酶。若結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和其他細(xì)胞化學(xué)染色，為臨床急性非淋巴細(xì)胞性白血病的分型和亞型確定提供重要的依據(jù)。2. -丁酸荼酚酯酶染色也可結(jié)合POX染色來綜合判斷結(jié)果，特別是如能將POX 染色與-丁酸荼酚酯酶染色聯(lián)合顯示于一張標(biāo)本片上，這比分別染色效果要更好，對M2、M4、M5的分型尤為突出。 將AS-DNCE染色與-丁酸荼酚酯酶染色同顯示于一張標(biāo)本片上，即雙醋染 色，可使單核細(xì)胞和粒細(xì)胞系分辨的更為清楚, 并且能發(fā)現(xiàn)在同一個細(xì)胞上同時存在二種酯酶呈陽性反應(yīng), 稱酯酶雙表現(xiàn)型細(xì)胞，為M4的診斷與分型提供了有力依據(jù)。操作步驟:將新鮮涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗。先將-NB

35、E液和液置入-NBE液中溶解混和(可先吸取少量-NBE液分別置入-NBE、液內(nèi)，待-NBE、液充分溶解后再一起置入-NBE液內(nèi))成為基質(zhì)液。將涂片置入后，37放置30分鐘，連缸流水沖洗35分鐘。蘇木素復(fù)染12分鐘，水洗待干，鏡檢。NaF抑制試驗:將新鮮涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，（4）30秒水洗。先將-NBE液和液置入-NBE液中溶解混和(可先吸取少量-NBE液分別置入-NBE、液內(nèi)，待-NBE、液充分溶解后再一起置入-NBE液內(nèi))，再加入NaF一瓶（訂貨時可向公司要求配置）成為基質(zhì)液。將涂片置入后，37放置30分鐘，連缸流水沖洗35分鐘。蘇木素復(fù)染12分鐘，水洗待干，鏡檢結(jié)果顯示：陰

36、性 （）胞質(zhì)無沉淀物（無色）陽性 （+）胞質(zhì)見淡棕紅色，無顆?；蛴猩倭考?xì)小顆粒。（+）胞質(zhì)見棕紅色，有較粗棕紅色顆粒但小于胞質(zhì)1/2面積。（+）胞質(zhì)見粗大棕紅色顆粒，可達(dá)胞質(zhì)面積3/4以上。（+） 胞質(zhì)見粗大棕褐色顆粒，達(dá)胞質(zhì)全部面積甚至可掩蓋于胞核上。注意事項：1. 酶的活性隨標(biāo)本采集后的時間而逐步下降，如無法及時染色，應(yīng)先固定，否則將影響陽性結(jié)果。2. 每次操作均須取正常標(biāo)本做陰、陽性同步對照。3. 此染色沖洗時間需適當(dāng)延長，特別在冬天，易使涂片表面產(chǎn)生脂質(zhì)沉淀,引起背景污染影響結(jié)果觀察。4. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。5. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位,最好

37、選擇體尾交接處,有時不同部位其陽性強度可相差二個(+)以上。作NaF抑制率計算時需特別注意。常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期太久 從新購買試劑盒 載玻片未洗凈標(biāo)本被污染 取干凈玻片從新采集標(biāo)本 標(biāo)本放置時間過久且未固定 從新采集標(biāo)本并立即固定，在三天內(nèi)檢測完畢固定液使用時大于4另取標(biāo)本重新用4固定液固定 采用了加有抗凝劑的標(biāo)本從新采集標(biāo)本 標(biāo)本沾遇其他化學(xué)物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標(biāo)本重新染色 試劑配制時 、 液未完全置入液內(nèi)或未完全溶解 需取新試劑從新配制 試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制 孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景

38、太復(fù)雜背景細(xì)胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標(biāo)本重新染色 染色后沖洗方法不當(dāng)不能先倒掉染液，應(yīng)連染色缸置流水沖洗染液，23分鐘復(fù)染后水洗時間不夠復(fù)染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復(fù)染液一起沖洗 七、過碘酸一雪夫反應(yīng)periodic acid Schiff reaction ,PAS原理:血細(xì)胞內(nèi)含乙二醇的糖類物質(zhì)（PAS）能被過碘酸氧化，形成雙醛基類物質(zhì)。后者與無色品紅結(jié)合，形成紫紅色沉淀物，沉淀物的顯色深淺與乙二醇的含量成正比。正常細(xì)胞反應(yīng) :1. 粒細(xì)胞系-原粒細(xì)胞多呈陰性, 通常隨細(xì)胞不斷成熟陽性反應(yīng)由弱漸強, 至細(xì)胞完全成熟后達(dá)到最大強度。其中，中性粒細(xì)胞呈胞質(zhì)內(nèi)彌散狀紅色

39、陽性，嗜酸粒細(xì)胞S顆粒之間的胞質(zhì)呈紅色陽性，嗜堿粒細(xì)胞呈大小不一的顆粒狀紫紅色陽性。2. 單核細(xì)胞系-各階段部分單核細(xì)胞可呈彌散伴細(xì)小顆粒狀紅色陽性。定位于胞質(zhì)內(nèi)。3. 淋巴細(xì)胞系-由于亞群的關(guān)系, 可有所不同,T-細(xì)胞僅一小部分可呈粗顆粒和小快狀陽性，但B-細(xì)胞絕大部分呈陽性反應(yīng)。4. 紅細(xì)胞系-紅細(xì)胞系的各個階段皆呈陰性反應(yīng)，偶見少數(shù)幼紅細(xì)胞有較弱的陽性反應(yīng)。5. 巨核細(xì)胞系- 巨核細(xì)胞和血小板呈彌散性和粗大顆粒狀強陽性反應(yīng)，且隨細(xì)胞成熟而增強。定位于胞質(zhì)內(nèi)。6. 其他-漿細(xì)胞呈陰性反應(yīng), 偶見少數(shù)呈較弱陽性。巨噬細(xì)胞可呈陽性反應(yīng)。均定位于胞質(zhì)內(nèi)。臨床評價：1. 能被過碘酸一雪夫反應(yīng)呈陽性

40、的多糖類物質(zhì)有糖原、粘多糖、糖蛋白、糖脂 , 還包括一些磷脂類物質(zhì)等, 因此PAS陽性不能簡單地就表明有糖原的存在, 只是在對血細(xì)胞的組織化學(xué)研究中通常習(xí)慣于將PAS陽性認(rèn)同于糖原。2.PAS染色雖然不完全代表糖原,但在血液系統(tǒng)疾病特別在各類型白血病中卻有較大的應(yīng)用價值。(1) 粒細(xì)胞系統(tǒng): 糖原是保障中性粒細(xì)胞吞噬功能的能量來源,所以在急性炎癥時PAS染色陽性程度明顯增強, 在淋巴系統(tǒng)惡性增生性疾病、真性紅細(xì)胞增多癥、類白血病反應(yīng)等時亦可增強, 在粒細(xì)胞系統(tǒng)惡性增生性疾病如急粒、慢粒等, 其陽性程度可減低。(2) 紅細(xì)胞系統(tǒng):PAS染色在紅細(xì)胞疾病中具有較大的使用價值，在大部分紅血病、紅白血

41、病及部分重型海洋貧血等疾病中可呈強陽性反應(yīng), 部分缺鐵性貧血、重型海洋貧血、MDS、骨髓硬化癥等可見陽性反應(yīng)。其它類型的貧血如巨幼紅細(xì)胞性貧血、再生障礙性貧血、溶血性貧血等均為陰性反應(yīng)。(3) 巨核細(xì)胞和血小板系統(tǒng): 巨核細(xì)胞胞漿中存有糖原和粘多糖兩類物質(zhì)，糖原呈粗大紫紅色顆?；驂K狀，粘多糖呈彌散狀紅色細(xì)顆粒, 二者遍布于整個胞漿之中。此為一般血液細(xì)胞所不具有，利用此特點有助于與惡性細(xì)胞相鑒別, 并結(jié)合電鏡PPO染色, 免疫表型檢測以確定原始巨核細(xì)胞的存在和對M7的診斷。(4) 淋巴細(xì)胞系統(tǒng): 淋巴細(xì)胞糖原的改變主要體現(xiàn)在不同類型的淋巴細(xì)胞克隆性增生疾病之, 其中尤以B-細(xì)胞惡性增多改變較為明

42、顯，如慢淋、淋巴肉瘤、急性B-細(xì)胞白血病等疾病的PAS陽性率和陽性強度可明顯提高。而T-細(xì)胞惡性病變PAS強度無明顯改變,另外，淋巴細(xì)胞由于感染引起的增多通常PAS多在正常范圍之內(nèi)。3.PAS 染色雖不能特異地表示何種病理改變，但結(jié)合其它細(xì)胞化學(xué)染色和細(xì)胞免疫表型檢測及超微結(jié)構(gòu)檢查等,對部分疾病的診斷和鑒別診斷具一定價值, 如MDS、M6與其它類型貧血的鑒別；原淋細(xì)胞與原單核細(xì)胞、原粒細(xì)胞的鑒別 ;M6與M7的鑒別、高-雪細(xì)胞與尼曼達(dá)克細(xì)胞的鑒別、 (Reed-Sternberg) 瑞-斯細(xì)胞和巨核細(xì)胞的鑒別、骨髓轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞與白血病細(xì)胞的鑒別。操作步驟:涂片滴加固定液58滴，蓋滿血膜即可，

43、5分鐘，水洗待干。滴加PAS液10分鐘(若實驗室溫度較低可適當(dāng)延長510分鐘)，水洗待干。置入PAS液內(nèi)室溫（2025左右為宜）暗處放置30分鐘，然后小心取出涂片流水沖洗數(shù)分鐘。蘇木素復(fù)染l2分鐘，水洗待干，鏡檢。結(jié)果顯示：陰性 （）胞質(zhì)內(nèi)無色。陽性 （+）胞質(zhì)內(nèi)呈淡紅色或有少量細(xì)小紅色顆粒。（+）胞質(zhì)呈紅色或有10個以上紅色顆粒。（+） 胞質(zhì)呈暗紅色或有粗大紅色顆粒，可出現(xiàn)紅色塊狀。（+） 胞質(zhì)呈紫紅色或有粗大紅色塊狀。注意事項:1.標(biāo)本除新鮮涂片外, 保存較好未被污染的涂片也可使用。2.標(biāo)本和器材應(yīng)避免被還原基團的物質(zhì)所污染, 以免出現(xiàn)假陽性。3. 涂片經(jīng)PAS液氧化水洗后, 必須待涂片徹

44、底干燥后方可置入PAS液中, 以免細(xì)胞間隙中的殘留水份導(dǎo)致整張涂片呈鮮紅色, 影響結(jié)果觀察。4. 每次操作均須取正常標(biāo)本做陰、陽性同步對照。5. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。6. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位,最好選擇體尾交接處,有時不同部位其陽性強度可相差二個(+)以上。7. 染色后應(yīng)及時觀察結(jié)果, 或用中性樹膠封片, 以利長期保存。常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期從新購買試劑盒 試劑開封后未蓋緊開啟新試劑盒PAS開封后混入雜質(zhì)或水造成試劑變質(zhì)返紅開啟新試劑盒 載玻片未洗凈標(biāo)本被污染 取干凈玻片從新采集標(biāo)本 采用了加有抗凝劑的

45、標(biāo)本從新采集標(biāo)本標(biāo)本沾遇其他化學(xué)物質(zhì)維生素C、 甲醛等采用未被污染的標(biāo)本重新染色標(biāo)本在液內(nèi)氧化時間不夠 另取標(biāo)本和新試劑從新操作試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間染色背景太復(fù)雜標(biāo)本在液內(nèi)氧化水洗后未徹底干透 若影響觀察需另取標(biāo)本重新染色 背景細(xì)胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標(biāo)本重新染色染色后沖洗方法不當(dāng) 不要連染色缸一起置流水沖 復(fù)染后水洗時間不夠復(fù)染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復(fù)染液一起沖洗 八、鐵染色（Iron stalnlng）原理：骨髓中的細(xì)胞內(nèi)外鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，形成藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵部位。藍(lán)色沉

46、淀顆粒的多少和深淺與細(xì)胞內(nèi)外鐵的含量成正比。正常細(xì)胞反應(yīng) :骨髓鐵包括幼紅細(xì)胞外鐵和幼紅細(xì)胞內(nèi)鐵二部分。細(xì)胞外鐵正常為 ( 十 )(+) 細(xì)胞內(nèi)鐵正常為 1944%幼紅細(xì)胞陽性 , 型為主，少數(shù)型。且無環(huán)行鐵粒幼紅細(xì)胞及鐵粒紅細(xì)胞。臨床評價 :1. 骨髓鐵包括細(xì)胞內(nèi)鐵和細(xì)胞外鐵。細(xì)胞內(nèi)鐵為幼紅細(xì)胞合成血紅蛋白時的利用形式, 而細(xì)胞外鐵是骨髓以含鐵血黃素形式存在的貯存鐵。骨髓鐵染色可了解骨髓中幼稚紅細(xì)胞對鐵利用的功能和鐵原料在機體內(nèi)的吸收與貯存情況, 但外鐵在檢測時易受到取材、儀器、試劑等因素的干擾, 就其價值來說不及細(xì)胞內(nèi)鐵高。2. 細(xì)胞內(nèi)外鐵減低或消失, 見于鐵原料攝入性降低, 鐵吸收功能障

47、礙或鐵的丟失和消耗過度, 使幼紅細(xì)胞血紅蛋白合成量減少或障礙, 如臨床常見的缺鐵性貧血及能引起機體缺鐵的相關(guān)性疾病,如鉤蟲病、ITP 等均能使機體中細(xì)胞內(nèi)外鐵減, 產(chǎn)生貧血癥狀, 因此對骨髓鐵的檢測是診斷缺鐵性貧血最重要且較早期的指標(biāo)之一。3. 細(xì)胞內(nèi)外鐵增多性疾病見于機體造血功能障礙, 鐵利用和轉(zhuǎn)換能力下降或遲緩及外源性含鐵物質(zhì)的多次輸入等。臨床常見的有:再生障礙性貧血、鐵粒幼細(xì)胞貧血、骨髓增生異常綜合征、溶血性貧血、白血病等, 均可引起細(xì)胞內(nèi)外鐵的增多。4. 如將鐵染色與血清鐵、總鐵結(jié)合力等檢測綜合觀察, 可了解機體內(nèi)鐵的動態(tài)變化, 機體對鐵劑治療的早期效果, 可了解骨髓代償造血的能力,

48、所以我們只要嚴(yán)格控制鐵染色操作技術(shù), 抓住取材、涂片、染色等幾個重要環(huán)節(jié), 對結(jié)果嚴(yán)格辨認(rèn), 就能使細(xì)胞內(nèi)外鐵染色在各種貧血的診斷、鑒別診斷中發(fā)揮更大作用。操作步驟：骨髓涂片滴加固定液58滴，蓋滿骨髓膜即可。10分鐘水洗待干、備用。將鐵染色液緩緩滴入鐵染色液內(nèi)，混勻后放入固定好的骨髓涂片，置入37水浴箱內(nèi)放置60分鐘，然后連缸流水沖洗數(shù)分鐘。核固紅復(fù)染35分鐘，水洗待干，鏡檢。結(jié)果顯示：細(xì)胞外鐵：陰性 （）細(xì)胞外和細(xì)胞間隙中無藍(lán)色沉淀物（無色）。陽性 （+）細(xì)胞外和細(xì)胞間隙中見少數(shù)藍(lán)色顆粒。（+）細(xì)胞外和細(xì)胞間隙中見較多藍(lán)色鐵顆粒和鐵小珠。（+） 細(xì)胞外和細(xì)胞間隙中見很多藍(lán)色鐵顆粒和鐵小珠。（

49、+）細(xì)胞外和細(xì)胞間隙中見極多藍(lán)色鐵顆粒和鐵小珠并可見鐵小塊。細(xì)胞內(nèi)鐵：陰性 （）細(xì)質(zhì)內(nèi)無藍(lán)色沉淀物（無色）陽性 （） 胞質(zhì)見12個藍(lán)色細(xì)小顆粒。（） 胞質(zhì)見2個以上藍(lán)色顆粒。（） 胞質(zhì)見14個藍(lán)色粗大顆粒。（） 胞質(zhì)見5個以上藍(lán)色粗大顆粒。注意事項:1.標(biāo)本取材要滿意。外鐵檢查要選擇含有髓小粒的涂片, 如標(biāo)本保存得當(dāng),陳舊骨髓涂片也可使用。2. 所用載玻片及相關(guān)器皿應(yīng)經(jīng)去離子水洗滌(至少為雙蒸水), 除去載玻片和器皿上可能存有的污染鐵, 此點對外鐵檢測特別重要。3. 試劑要新鮮配置, 如二者混合后試劑顏色變綠則表示受污染不能使用。4. 復(fù)染時應(yīng)采用縱向, 一半不復(fù)染以利觀察細(xì)胞外鐵, 另一半復(fù)

50、染以利觀察細(xì)胞內(nèi)鐵。在尋找細(xì)胞外鐵時, 最好能在吞噬細(xì)胞體內(nèi)看到鐵顆粒, 其比在細(xì)胞外看到鐵顆粒更有意義。5. 通常計算幼紅細(xì)胞內(nèi)鐵染色積分時以中晚幼紅為主, 原紅和早幼紅不計入百分比內(nèi)。為使結(jié)果準(zhǔn)確,應(yīng)選擇不同的區(qū)域和部位仔細(xì)觀察,避免發(fā)生遺漏和差錯。6. 每次操作均須取正常標(biāo)本做陰、陽性同步對照。7. 實驗室操作人員最好相對穩(wěn)定，可使結(jié)果穩(wěn)定得以減少室內(nèi)誤差。8. 觀察結(jié)果時需注意涂片的部位，最好選擇體尾交接處。 常見問題與解決方法：常見問題原因解決方法未見陽性或陽性減弱 試劑盒過期從新購買試劑盒 試劑被污染變色 需取新試劑從新配制 載玻片未洗凈標(biāo)本被污染取干凈玻片從新采集標(biāo)本 采用了加有

51、抗凝劑的標(biāo)本從新采集標(biāo)本標(biāo)本沾遇其他化學(xué)物質(zhì)乙醚、二甲苯等 采用未被污染的標(biāo)本重新染色試劑配制時液未完全置入液內(nèi) 液開啟時間過長需取新試劑從新配制試劑配制后未及時使用 需取新試劑從新配制孵育時間或溫度不夠 調(diào)整溫度或孵育時間 染色背景太復(fù)雜標(biāo)本被鐵污染采用未溶血的標(biāo)本重新染色 背景細(xì)胞染色過深 孵育時間太長，若影響觀察需另取標(biāo)本重、新染色染色后沖洗方法不當(dāng)不能先倒掉染液，應(yīng)連染色缸置流水沖洗染液，23分鐘復(fù)染后水洗時間不夠復(fù)染后水洗時間通常為35分鐘而且須連復(fù)染液一起沖洗 九、白血病細(xì)胞免疫分型測定檢測原理：利用細(xì)胞膜表面所特有的分化抗原對細(xì)胞進行鑒別和分型，將免疫酶標(biāo)技術(shù)運用于普通骨髓(血)

52、涂片?？梢赃_(dá)到準(zhǔn)確區(qū)別各種類型血液細(xì)胞的目的。本公司采用目前國際上較為先進的免疫組化二步法，并選擇國際上被公認(rèn)的一線單抗和部分常用二線單抗，運用AP染色技術(shù)，只需2-3張普通推制的骨髓(血)涂片即可。該法具有靈敏度高，操作簡便，試劑用量較少，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，背景清晰，無需特殊儀器(僅用一臺普通光學(xué)顯微鏡)、陽性結(jié)果保存時間長（便于會診），整個操作過程耗時僅需2小時即可獲得滿意的結(jié)果。能基本滿足臨床上對于各類型急、慢性白血病細(xì)胞的免疫分型檢測。在血液和骨髓細(xì)胞中有一部分細(xì)胞含有非常豐富的內(nèi)源性過氧化物酶，雖然在操作時可采取一些措施來抑制細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶，但這種處理比較粗糙，往往不能完全抑制該

53、細(xì)胞內(nèi)源酶的活性，又可造成部分細(xì)胞表面抗原的破壞或丟失。而對血液系統(tǒng)中許多惡性疾病的診斷，通常是檢測其細(xì)胞表面的分化抗原。再則在血液和骨髓組織中，還存在大量的成熟紅細(xì)胞。其中的血紅蛋白對本法也會產(chǎn)生強烈的干擾，(因血紅蛋白具過氧化物酶的功能)，可對被檢標(biāo)本的背景產(chǎn)生難以去除的非特異性染色。從而導(dǎo)致結(jié)果難以判斷。所以在血液學(xué)中的細(xì)胞免疫組化染色，應(yīng)該首選堿性磷酸酶(AP)顯色系統(tǒng)。而盡量不采用辣根過氧化酶（HIP）顯色系統(tǒng)。正常細(xì)胞反應(yīng):1. T-淋巴細(xì)胞- CD3、CD5、CD7等標(biāo)記可部分或全部表達(dá)，其他系列標(biāo)記均不表達(dá)。2. B-淋巴細(xì)胞- CD10、CD19、CD20、HLA-DR等標(biāo)記可部分或全部表達(dá)，其他系列標(biāo)記均不表達(dá)。3. 髓系細(xì)胞- CD13、CD14、CD33、CD34、CD68、MPO、HLA-DR等標(biāo)記可部分或全部表達(dá)，其他系列標(biāo)記均不表達(dá)。 巨核細(xì)胞- CD41、HLA-DR、等標(biāo)記可部分或全部表達(dá)，其他系列標(biāo)記均不表達(dá)。 臨床評價 :