二代測序簡介

1、 第二代測序技術(shù)簡介第二代測序技術(shù)簡介公司理念公司理念：毅新興業(yè)以生命科學(xué)研究為本，致力于科學(xué)技術(shù)服務(wù)，為客戶提供完美的科研平臺 。 基因組基因組 SNPs（包括芯片、massarray） 第二代大規(guī)模測序 病毒包裝 miRNA表達(dá)譜 蛋白組蛋白組 血清多肽譜 2DE LC-MS（Shotgun法） 代謝組代謝組 NMR LC-MS自主儀器自主儀器 恒溫金屬浴 梯度PCR儀 恒溫振蕩儀Squenom質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀SAI質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀 MALDI TOF/TOF測序儀：測序儀：Polonator G.007 試劑試劑自主研發(fā)液體蛋白磁珠SBI試劑慢病毒RNA干擾庫MicroRNA研究干細(xì)胞研究3內(nèi)容

2、提綱內(nèi)容提綱從Sanger法到新一代測序技術(shù)第二代測序平臺介紹第二代測序技術(shù)應(yīng)用 宏基因組學(xué)（Metagenomics） 泛基因組學(xué)（Pangenomics）Key Genomics Technologiesl 1975 - Southern DNA hybridization techniquel 1977 - Sangers chain-termination and Maxam、Gilberts chemical DNA sequencing methodsl 1980 - Automated in situ oligonucleotide synthesis instrumentl 1

3、985 - Mulliss discovery of PCR at Cetusl 1992 - Affymatrix (Fodors group) first gene-chipl 1995 - ABIs first automated DNA sequencerl 2006 - 2nd generation DNA sequencer on marketl 2007 and beyond Single molecule sequencing techniquesSangers MethodlLabeled primer (1)lSequence reactions (4)lSequence

4、separations (4)lSequence read-out1st-Generation Automated DNA SequencerParallel runs on 96 capillaries on ABI 3700Limitation of 1st Gen SequencerlThroughput lTime-consuming separation of chain-terminated fragmentslHard to produce massively parallel system based electrophoretic separation lSequencing

5、 CostlSample handling lDifficult to miniaturizeNeed for Faster and Cheaper Sequencing TechnologyPersonal Genome ProjectTrends in Next-Generation Sequencingl Large-scale and high-throughputl Amplification on solid surface l Cluster generation (bridge or polony amplification )l Emulsion PCR (fragment

6、on beads)l In situ sequencing by chain extensionl Sequence by synthesis DNA polymerase l Sequence by ligation DNA ligasel Massively parallel processingl Array of clusters, beadsl Miniaturization through microfluidicl Single molecule detection測序技術(shù)目標(biāo)測序技術(shù)目標(biāo)陳竺，日本血吸蟲基因組人類全基因組測序的目人類全基因組測序的目標(biāo)：標(biāo)：1000美元美元/人人

7、2008年預(yù)測年預(yù)測5年內(nèi)實(shí)現(xiàn)年內(nèi)實(shí)現(xiàn)2006年底，美國X大獎(jiǎng)基金會設(shè)立了基因組Archon X大獎(jiǎng)，獎(jiǎng)金高達(dá)1000萬美元。這項(xiàng)大獎(jiǎng)將頒給第一個(gè)能在10天之內(nèi)，用不到100萬美元的費(fèi)用，完成100個(gè)人類基因組測序的團(tuán)隊(duì)。附加條件是覆蓋率不小于98%，誤差不大于1/100000 bp。Next-Gen PlatformslGA Illumina/SolexalSBS with reversible fluorescent terminatorslGS FLX Roche/454 Life ScienceslSBS through pyrosequencing lSOLiD ABI/Agenco

8、urtlSBL with dual base encodinglPOLONATOR Danaher MotionlSBL with base encodingNext-Gen Sequencing WorkflowFragment Library PreparationlRandomlPair-endImmobilization of Fragment lSurface, BeadlCovalent or non-covalentSequential Sequence Extension ReactionlPolymeraselLigaseImage Acquisition and Proce

9、ssinglFluorescencelChemiluminescenceSequence Read and AssemblyClonal AmplificationlEmulsion PCRlColony/Cluster2nd Generation PerformanceGS 454SOLiDSOLEXAPOLONATOR技術(shù)原理聚合酶聚合酶/焦磷酸酶焦磷酸酶連接酶連接酶聚合酶聚合酶連接酶連接酶單運(yùn)數(shù)據(jù)產(chǎn)量0.40.6Gb50Gb20Gb20G覆蓋人基因組0.217617 平均讀長（bp）400501002302樣品準(zhǔn)備2天天7天天9小時(shí)小時(shí)7天天運(yùn)行時(shí)間10小時(shí)小時(shí)8天天9.5天天1周周精確

10、度9999.9498.599%單次運(yùn)行價(jià)格7萬元萬元3.5萬元萬元2.5萬元萬元40% offRoche/454 Life Sciences Genome SequencerRoche/454 Workflow DNA Library PrepDNA FragmentEnd repairedAsymetric Adaptors ligated (one biotinylated)Immobilized on streptavidin coated magnetic beadsDenatured - ss template DNA libraryPurifiednEmulsion Amplifi

11、cationnTemplate DNA immobilized on primer coated capture beads thru hybridization (1 fragment on each bead)nThermocyle to amplify (forward primer is biotinylated)nAmplified beads enriched with streptavidin coated magnetic beadsRoche/454 Workflow Bead Deposition One amplified bead per microwell Follo

12、wed by enzyme beads and packing beads Enzyme beadsSulfurylaseLuciferase Packing beads help to keep DNA bead in microwellnPyrosequencingn4 nucleotides sequentially flow innIncorporation of a nucleotide releases a pyrophosphate (PPi)nSufurylase convert PPi into ATPnATP hydrolized by luciferase using l

13、uciferin to produce lightPyrosequencingConvert PPi to ATPUse ATP to generate lightRemove (d)NTPs and excess ATP Roche/454 Workflow Image AcquisitionBy CCD camera coupled to the picotiterplateChemiluminescent intensity reflects number of nucleotide incorporated in each flow; used to determine homopol

14、ymer regionUp to 100 cycles repeatednPost-acq ProcessingnDe novo sequencingnResequencingnAmplicon variant analysisnImage ProcessingnChemiluminescent event maped to wellnFlowgram generated for each wellnBase calledRoche/454 Life Sciences Genome Sequencer 速度快，一個(gè)測序反應(yīng)耗時(shí)10個(gè)小時(shí)，獲得100余萬個(gè)讀長和4-6億個(gè)堿基對。 測序讀長最長，

15、單個(gè)序列的讀長更長，平均可達(dá)到400-500個(gè)堿基左右 準(zhǔn)確度高，讀長超過400bp時(shí)，單一讀長的準(zhǔn)確性可以超過99%； 一致性好，測序結(jié)果一致性超過99.99%； 可以進(jìn)行PairEnd測序研究； 功能強(qiáng)大的基因組分析工具功能強(qiáng)大的基因組分析工具 Polonator G.007 Polonator系統(tǒng)是由Dr. George Church和他的研究小組發(fā)明，該系統(tǒng)使用了美國最先進(jìn)試劑處理和檢測的部件，采用了最敏感的檢測設(shè)備，現(xiàn)在已發(fā)展成為一個(gè)包含多個(gè)基因組學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的研究平臺，并且承擔(dān)了美國“Personal Genome Project”的個(gè)人基因組測序任務(wù)。Polonator G.007

16、最大的優(yōu)勢在于開機(jī)運(yùn)行成本低和Linux 開放資源軟件。 Polonator G.007 Workflow配對末端文庫制備配對末端文庫制備：配對末端文庫是將基因組DNA打斷后，與中間接頭連接，再環(huán)化，然后用Mme1酶切，使中間接頭兩端各有30bp的堿基，再加上兩端的接頭，形成文庫。乳液乳液PCR：在微反應(yīng)器中加入測序模板、PCR反應(yīng)元件、微珠和引物，進(jìn)行乳液PCR（Emulsion PCR）。微球富集和固定微球富集和固定：PCR完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。將微珠沉積在一塊玻片上，微珠上的模板經(jīng)過3修飾，可以與玻片共價(jià)結(jié)合。連接反應(yīng)測序連接反應(yīng)測序：polonat

17、or連接反應(yīng)的底物是9堿基單鏈熒光探針混合物。探針的5末端分別標(biāo)記了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對，結(jié)合的探針就提供了一個(gè)熒光檢測信號，最終被儀器識別。 Polonator G.007數(shù)據(jù)量 每次運(yùn)行可以得到10Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù) 運(yùn)行時(shí)間 80小時(shí) 讀長 30bp2，每次運(yùn)行可以讀取1.2 1.3109個(gè)磁珠 準(zhǔn)確性 超過99% 運(yùn)行成本 僅為目前二代測序系統(tǒng)運(yùn)行成本的60% 樣品數(shù)/運(yùn)行 同時(shí)支持2 8道最多16個(gè)樣品測序Illumina/Solexa- Genome Analyzer Illum

18、ina Genome Analyzer是一種基于單分子簇的邊合成邊測序技術(shù)，它基于專有的可逆終止化學(xué)反應(yīng)原理。Illumina/Solexa WorkflowSolexa Genome Analyzer 測序通量高：每次運(yùn)行后可獲得30 GB的高品質(zhì)過濾數(shù)據(jù)； 簡單、快速、自動(dòng)化：制備樣品文庫可以在幾小時(shí)內(nèi)完成，一個(gè)星期內(nèi)就能得到高精確度的數(shù)據(jù)； DNA序列的讀取長度不斷增加，當(dāng)前達(dá)到100 bp； 單個(gè)或配對末端支持：Genome Analyzer系統(tǒng)支持單個(gè)片段或配對末端文庫； 每張芯片有8個(gè)通道，每個(gè)通道可單獨(dú)測序一個(gè)樣品，也可以把多個(gè)樣品混合在一起測序。ABI SOLiD Librar

19、y PrepnSheared fragments are tagged with adapters (A1 and A2) to each endABI SOLiD Emulsion PCRnEmulsion PCR performed using DNA fragments from library on beads (m) coatd with one of the primers ABI SOLiD Bead DepositionnAmplified bead enriched on polystyrene beads coated with A2 adaptor; any bead c

20、ontaining the extended products will bind polystyrene bead through its P2 end. This increase the throughput of beads with targeted DNA from 30% to 80%n3 end of enriched product modified to allow covalent attachement to glass slide surface randomlyFluorescent ProbesABI SOLiD Sequence by LigationnUse

21、dual base encoding through 8-mer probes with a ligation site at the 3 end, a fluorescent dye at the 5 end, and a cleavage site between the fifth and sixth nucleotidenEach color represents two nucleotides in which the second base of each dinucleotide unit constitutes the first base of the following d

22、inucleotide, knowing just one base in the sequence will lead us to interpret the whole sequence Next-Gen Research Applicationsde novo 測序測序全基因組重測序全基因組重測序/基因組結(jié)構(gòu)變異基因組結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組測序/外顯子測序外顯子測序小分子小分子RNA測序分析測序分析宏基因組學(xué)（宏基因組學(xué)（Meta-Genomics）泛基因組學(xué)（泛基因組學(xué)（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP測序測序 35Genome sequencing pro

23、jects statisticsOrganismCompleteDraft assemblyIn progresstotalProkaryotes979106710183064Archaea671338118Bacteria91210549802946Eukaryotes22189169380Animals47559138Mammals2281848Birds 213Fishes 369Insects121729Flatworms 224Roundworms191121Amphibians 11Reptiles 11Other animals 121426Plants2124458Land p

24、lants293849Green Algae 369Fungi107638124Ascomycetes8602694Basidiomycetes110819Other fungi16411Protists6242454Apicomplexans111719Kinetoplasts1258Other protists4101226Next-Gen Research Applicationsde novo 測序測序全基因組重測序全基因組重測序/基因組結(jié)構(gòu)變異基因組結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組測序/外顯子測序外顯子測序小分子小分子RNA測序分析測序分析宏基因組學(xué)（宏基因組學(xué)（Meta-Genomics）

25、泛基因組學(xué)（泛基因組學(xué)（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP測序測序 人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃Human Genome Project 1000 Genomes Project Personal Genome Project Cancer Genome Project Next-Gen Research Applicationsde novo 測序測序全基因組重測序全基因組重測序/基因組結(jié)構(gòu)變異基因組結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組測序/外顯子測序外顯子測序小分子小分子RNA測序分析測序分析宏基因組學(xué)（宏基因組學(xué)（Meta-Genomics）泛基因組學(xué)（泛基因組學(xué)（ Pang

26、enome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP測序測序 轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組測序/外顯子測序外顯子測序轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究：UTR鑒定、鑒定、Intron邊邊界鑒定、可變剪切研究等。界鑒定、可變剪切研究等。 非編碼區(qū)域功能研究：非編碼區(qū)域功能研究：non-coding RNA研究、研究、microRNA前體研究等。前體研究等。 基因轉(zhuǎn)錄水平研究基因轉(zhuǎn)錄水平研究 全新轉(zhuǎn)錄區(qū)域研究全新轉(zhuǎn)錄區(qū)域研究 千種植物轉(zhuǎn)錄組研究計(jì)劃千種植物轉(zhuǎn)錄組研究計(jì)劃 Next-Gen Research Applicationsde novo 測序測序全基因組重測序全基因組重測序/基因組結(jié)構(gòu)變異基因組結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄組測

27、序轉(zhuǎn)錄組測序/外顯子測序外顯子測序小分子小分子RNA測序分析測序分析宏基因組學(xué)（宏基因組學(xué)（Meta-Genomics）泛基因組學(xué)（泛基因組學(xué)（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP測序測序 小分子小分子RNA測序分析測序分析新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的預(yù)測和鑒定樣品間差異表達(dá)分析miRNAs聚類和表達(dá)譜分析等 Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活動(dòng)重要的調(diào)控因子，在基因表達(dá)調(diào)控、生物個(gè)體發(fā)育、代謝及疾病的發(fā)生等生理過程中起著重要的作用。Next-Gen Research Applicationsde novo 測序測

28、序全基因組重測序全基因組重測序/基因組結(jié)構(gòu)變異基因組結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組測序/外顯子測序外顯子測序小分子小分子RNA測序分析測序分析宏基因組學(xué)（宏基因組學(xué)（Meta-Genomics）泛基因組學(xué)（泛基因組學(xué)（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP測序測序 Metagenomics宏基因組學(xué) （也稱元基因組學(xué)、環(huán)境基因組學(xué)、生態(tài)基因組學(xué)）是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以測序分析和功能基因篩選為研究手段，研究微生物多樣性、 種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間關(guān)系的新方法。對特定環(huán)境微生物種群全基因組DNA研究，可以從整體上對樣品群落進(jìn)行

29、分析，不受微生物是否能培養(yǎng)的限制，而且研究對象從單一基因組到一個(gè)基因組集合，也擺脫了對于傳統(tǒng)基因組研究的物種限制，開辟了微生物群體基因組學(xué)研究的新路徑。Next-Gen Research Applicationsde novo 測序測序全基因組重測序全基因組重測序/基因組結(jié)構(gòu)變異基因組結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組測序/外顯子測序外顯子測序小分子小分子RNA測序分析測序分析宏基因組學(xué)（宏基因組學(xué)（Meta-Genomics）泛基因組學(xué)（泛基因組學(xué)（ Pangenome ）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP測序測序 PangenomePangenome (whole, supra-genome) is the total gene repertoire in a given species, including: core genome, which is shared by al