微生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)

1、微生物技術(shù)實(shí)驗(yàn) 產(chǎn)黑色素菌株的分離、選育和發(fā)酵產(chǎn)黑色素菌株的分離、選育和發(fā)酵真黑色素真黑色素(eumelanins)棕黑色素棕黑色素( phaeomelanins )異黑色素異黑色素(allomelanins)神經(jīng)黑色素神經(jīng)黑色素(neuromelanins)膿黑色素膿黑色素(pyomelanins)黑色素黑色素(melanin) 廣泛分布在動物、植物、真菌及細(xì)菌中的一類重要色素廣泛分布在動物、植物、真菌及細(xì)菌中的一類重要色素 基本單體及氧化還原產(chǎn)物基本單體及氧化還原產(chǎn)物 二級結(jié)構(gòu)模型圖二級結(jié)構(gòu)模型圖 結(jié)構(gòu)復(fù)雜、非均質(zhì)、異源多聚的芳香族化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、非均質(zhì)、異源多聚的芳香族化合物 研究背景研

2、究背景黑色素的分布及基本特征黑色素的分布及基本特征 黑色素的研究概況黑色素的研究概況 黑色素廣泛存在于生物界中的一類從紅色，黑色素廣泛存在于生物界中的一類從紅色，褐色到黑色的天然色素褐色到黑色的天然色素Natural red to black pigmentsNon-toxicity to environment and animals 黑色素含有自由基，這在天然物質(zhì)中很少黑色素含有自由基，這在天然物質(zhì)中很少見，而且它能象海綿一樣吸收環(huán)境中的自見，而且它能象海綿一樣吸收環(huán)境中的自由基由基 SEMAngel et al. J Immunol Methods 2000Lopez-Serrano e

3、t al. Microbiology 2007黑色素的類型及其合成途徑黑色素的類型及其合成途徑 真黑色素：多巴途徑真黑色素：多巴途徑 棕黑色素棕黑色素 ：酪氨酸氧化為多巴后，有半：酪氨酸氧化為多巴后，有半胱氨酸參與反應(yīng)胱氨酸參與反應(yīng) 異黑色素異黑色素 ：植物和微生物：植物和微生物 膿黑色素：尿黑酸途徑膿黑色素：尿黑酸途徑 神經(jīng)黑色素神經(jīng)黑色素 ：腦中產(chǎn)生：腦中產(chǎn)生 黑色素的研究概況黑色素的研究概況黑色素生物功能黑色素生物功能人體中，黑色素的種類和含量不同，造成頭發(fā)、皮膚、眼睛顏色的差異。人體中，黑色素的種類和含量不同，造成頭發(fā)、皮膚、眼睛顏色的差異。 防御功能防御功能烏賊和章魚釋放的墨汁作為煙

4、幕彈躲避捕食者。真菌細(xì)胞在感染過程中合成黑色素抵抗人體的免疫機(jī)制 。 抗輻射作用抗輻射作用黑色素有助于機(jī)體抵抗紫外線及其它各種輻射黑色素有助于機(jī)體抵抗紫外線及其它各種輻射，具有黑色孢子的真菌比無色孢子的真菌更能抵抗紫外線和太陽光的輻射。具有黑色孢子的真菌比無色孢子的真菌更能抵抗紫外線和太陽光的輻射。動物皮膚中的黑色素的產(chǎn)生是對紫外線輻射傷害的一種反應(yīng)，它是目前動物皮膚中的黑色素的產(chǎn)生是對紫外線輻射傷害的一種反應(yīng)，它是目前所知道的唯一的保護(hù)皮膚免受輻射傷害的天然生物聚合物。所知道的唯一的保護(hù)皮膚免受輻射傷害的天然生物聚合物。 外表修飾功能外表修飾功能 神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病與黑色素產(chǎn)生缺陷相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)

5、多種疾病與黑色素產(chǎn)生缺陷相關(guān)如著色性干皮病，帕金森氏病，老年性癡呆癥，亨廷氏舞蹈病等。如著色性干皮病，帕金森氏病，老年性癡呆癥，亨廷氏舞蹈病等。 清除自由基和活性氧物質(zhì)清除自由基和活性氧物質(zhì)能不斷吸收環(huán)境中的自由基，從而對生物體提供保護(hù)。能不斷吸收環(huán)境中的自由基，從而對生物體提供保護(hù)。 阻止病毒的感染阻止病毒的感染黑色素具有選擇性抗病毒活力，能阻止黑色素具有選擇性抗病毒活力，能阻止HIVHIV病毒、流感病毒對動物細(xì)胞的感染病毒、流感病毒對動物細(xì)胞的感染黑色素的研究概況黑色素的研究概況細(xì)菌黑色素合成關(guān)鍵酶細(xì)菌黑色素合成關(guān)鍵酶 酪氨酸酶酪氨酸酶酪氨酸酶的生化性質(zhì)及生理功能 酪氨酸酶（酪氨酸酶（EC

6、 1.14.18.1EC 1.14.18.1），廣泛存在于），廣泛存在于動物、植物及微生物中動物、植物及微生物中 特殊之處：同時具有兩種不同的催化活性：特殊之處：同時具有兩種不同的催化活性：以單酚物質(zhì)如酪氨酸為底物的單酚氧化酶以單酚物質(zhì)如酪氨酸為底物的單酚氧化酶的活性，又稱甲酚酶活性；以雙酚物質(zhì)如的活性，又稱甲酚酶活性；以雙酚物質(zhì)如左旋多巴為底物的雙酚氧化酶的活性，又左旋多巴為底物的雙酚氧化酶的活性，又稱為兒茶酚氧化酶活性稱為兒茶酚氧化酶活性 酪氨酸酶研究前沿酪氨酸酶研究前沿酪氨酸酶的的結(jié)構(gòu) 酪氨酸酶研究前沿酪氨酸酶研究前沿a)Octopus dofleini 血藍(lán)血藍(lán)蛋白；蛋白；b)Limu

7、lus polyphemus 血藍(lán)蛋白血藍(lán)蛋白c)Lpomoea batatas兒茶兒茶酚氧化酶；酚氧化酶；d)castaneoglobisporus(鏈霉菌鏈霉菌)酪氨酸酶；酪氨酸酶；e) 四個活性位點(diǎn)的重疊說四個活性位點(diǎn)的重疊說明四種蛋白活性中心具明四種蛋白活性中心具有高度的結(jié)構(gòu)相似性。有高度的結(jié)構(gòu)相似性。 1.1.合成左旋多巴和黑色素合成左旋多巴和黑色素 : :帕金森病帕金森病 等；等； 2.2.食品工業(yè)方面食品工業(yè)方面褐變：色澤褐變：色澤 3.3.有機(jī)合成及化學(xué)修飾有機(jī)合成及化學(xué)修飾 4.4.應(yīng)用于生物傳感器應(yīng)用于生物傳感器 ：檢測酚類等：檢測酚類等 酪氨酸酶的應(yīng)用酪氨酸酶的應(yīng)用 酪氨

8、酸酶研究前沿酪氨酸酶研究前沿實(shí)驗(yàn)步驟 分離產(chǎn)黑色素的細(xì)菌分離產(chǎn)黑色素的細(xì)菌 誘變育種誘變育種 發(fā)酵生產(chǎn)黑色素發(fā)酵生產(chǎn)黑色素 分離產(chǎn)黑色素的細(xì)菌分離產(chǎn)黑色素的細(xì)菌 在自然界中，土壤是微生物生活的大本營，是人類開發(fā)利用微生物資源的重要基地。分離微生物的策略分離微生物常用的方法： 稀釋平板分離法和劃線分離法實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟： 1、 土樣采集點(diǎn)的確定： 要求采集地具有代表性，能代表該地主要土壤類型和主要植被類型。2、 土壤取樣方法：將表層土鏟去5-10cm，用干凈的采樣鏟取約50g土，每個采樣點(diǎn)至少取10處，并將所采土樣裝于無菌塑料袋中混合，然后把樣品置通風(fēng)陰涼處碾碎。 3、 菌的分離：稱10g土樣

9、于水中，放入盛有90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩約20分鐘，使土樣與水充分混合，并使細(xì)胞分散。用一支1 ml無菌吸管吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，此為10-1稀釋液，以此類推做10倍稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液0.1ml涂布平板。28培養(yǎng)3天。4、 純化：挑取產(chǎn)黑色素(包括紅至褐色素)的單個菌落接種斜面，同時作涂片檢查，若有不純，應(yīng)進(jìn)一步挑取此菌落采用劃線分離或制成菌懸液作稀釋分離，直至獲得純培養(yǎng)。5、 復(fù)篩：將純化的菌種在篩選平板上劃線，28培養(yǎng)2天。6、 菌株性質(zhì)鑒定 菌落特征觀察在篩選平板上產(chǎn)黑色素菌落的特征。 革蘭氏染色顯微

10、鏡觀察 產(chǎn)黑色素的性質(zhì)觀察挑選菌株所產(chǎn)黑色素的基本性質(zhì)。 產(chǎn)黑色素的性質(zhì)觀察挑選菌株所產(chǎn)黑色素的基本性質(zhì)。 誘變育種誘變育種獲得獲得營養(yǎng)缺陷型（生物素）高產(chǎn)黑色素的菌株高產(chǎn)黑色素的菌株 實(shí)驗(yàn)原理 基因突變是微生物誘變育種的理論依據(jù)。生物經(jīng)理化因子的處理可以提高基因突變的頻率，因此采用物理因素或化學(xué)因素處理微生物，使其體內(nèi)的DNA發(fā)生改變，以提高突變頻率和擴(kuò)大遺傳變異的幅度，然后從中篩選出所需要的突變菌株，這便是誘變育種誘變育種。其中在營養(yǎng)上表現(xiàn)出某種缺陷的變異菌株，叫做缺缺陷型菌株陷型菌株。它是遺傳學(xué)研究和遺傳育種工作中不可缺少的重要材料。亞硝基胍（亞硝基胍（NGNG或NTGNTG）是一種廣泛

11、使用的強(qiáng)誘變劑。它主要在DNA鏈的復(fù)制區(qū)引起G:C A:T轉(zhuǎn)換，即使在殺菌率很低的情況下也能誘發(fā)高頻率的突變。對于細(xì)菌的處理一般通過制作殺菌曲線，采用殺菌率在70%-90%的誘變劑量處理微生物為好。 本實(shí)驗(yàn)采用亞硝基胍對分離菌株進(jìn)行誘變。主要用點(diǎn)種法和影印法檢出缺陷型菌落，并用生長譜法進(jìn)行鑒定，獲取生物素營養(yǎng)缺陷型高產(chǎn)黑色素的菌株。 誘變育種誘變育種 培養(yǎng)基LBLB培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）：培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）：蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 5g，蒸餾水 1000ml，pH7.0-7.2基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基MMMM：(NH4)2SO4 1g，K2HPO4 7g，KH2PO4 3g，檸

12、檬酸鈉 0.5g，MgSO47H2O 0.1g，葡萄糖 5g，蒸餾水 1000ml，pH自然（7.0）CuTYCuTY培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g， CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0 誘變育種誘變育種實(shí)驗(yàn)步驟 1、制備菌懸液 挑取少許斜面菌種接種于盛有5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，28振蕩培養(yǎng)過夜。 取0.5ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入另一盛有5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，28振蕩培養(yǎng)6-7小時。2、制作平板將LB固體培養(yǎng)基融化，倒平板，凝固后待用。 3、 涂平板 取0.1ml 上述菌液放到LB培養(yǎng)基平板上

13、，用無菌玻璃涂棒將菌液均勻地涂滿整個平板表面。 4、 誘變 在上述平板稍靠邊的一個位點(diǎn)上放少許亞硝基胍結(jié)晶，然后將平板倒置于培養(yǎng)箱中28培養(yǎng)24小時。 在放亞硝基胍的位置周圍將出現(xiàn)抑菌圈。 5、 涂布平板 挑取緊靠抑菌圈外側(cè)的少許菌苔到裝有4.5ml生理鹽水的試管中，搖勻，制成處理后菌懸液。 取上述菌懸液0.5ml于盛有4.5ml生理鹽水的試管中，稀釋到10-4。分別取10-1、10-2、10-3和10-4稀釋液涂布LB平板，每個平板涂0.1ml，經(jīng)誘變處理的稀釋液每稀釋度涂布3個平板，置28培養(yǎng)兩天。 ( (凡是有亞硝基胍的器皿，都要置于通風(fēng)處用凡是有亞硝基胍的器皿，都要置于通風(fēng)處用1N N

14、aOH1N NaOH溶液溶液浸泡，使殘余的亞硝基胍分解破壞，然后清洗。注意不要浸泡，使殘余的亞硝基胍分解破壞，然后清洗。注意不要讓含有讓含有NGNG的上清液滴在皮膚或衣物上的上清液滴在皮膚或衣物上) ) 6、營養(yǎng)缺陷型的檢出 點(diǎn)種法 取基本培養(yǎng)基(MM)和完全培養(yǎng)基(LB)平板，作好成對與方向的標(biāo)記(即一皿MM和一皿LB為一對)，將事先已編號的格子紙分別放在兩培養(yǎng)皿的底部。用無菌牙簽小心地在待測菌落表面挑取少許細(xì)胞，分別點(diǎn)在MM和LB培養(yǎng)皿的對應(yīng)位置上(先點(diǎn)MM，后點(diǎn)LB)。盡可能多點(diǎn)些菌落。置28培養(yǎng)兩天。 影印法 取無菌MM、LB培養(yǎng)基各一皿，在平皿底部畫箭頭作為方向標(biāo)記。選擇一個菌落分散

15、的培養(yǎng)皿作為母平皿，作如上標(biāo)記，并在影印板上也作同樣標(biāo)記。 將母平皿對好標(biāo)記倒放在影印板的絨布上，然后輕輕放下，立即把MM培養(yǎng)皿對好標(biāo)記倒放在影印板下，取下MM培養(yǎng)皿，再印Cu-TY培養(yǎng)板。 28培養(yǎng)兩天左右。 夾層法 取無菌培養(yǎng)皿3皿，各倒一薄層( 約5 ml )MM培養(yǎng)基，凝固后加入0.1 ml經(jīng)誘變處理的10-5倍稀釋液，再加入約5 ml的MM培養(yǎng)基，搖勻，凝固后再蓋上一層約5 ml的MM培養(yǎng)基。待凝固后置28培養(yǎng)兩天左右。 取出上述培養(yǎng)平板，在皿底把已長出的菌落作好標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)其菌落數(shù)，再蓋上一層約5 ml的半固體LB培養(yǎng)基。置28培養(yǎng)兩天。 上述三種方法中，在MM培養(yǎng)基上不長而在LB培

16、養(yǎng)基上生長的菌落可能是缺陷型菌株，需要進(jìn)一步復(fù)證。7、將可能為缺陷型的菌落編號，分別接入5ml LB液體培養(yǎng)基中，28振蕩培養(yǎng)過夜。 8、營養(yǎng)缺陷型的鑒定 初步鑒定取0.1 ml培養(yǎng)液涂布在MM培養(yǎng)基上。待干后：皿底按圖分成三個區(qū)域，并分別標(biāo)上A(混合氨基酸)，V(混合維生素)和B(堿基混合物)。在每一區(qū)域中央分別對應(yīng)地加入混合氨基酸、混合維生素和堿基混合物。置28培養(yǎng)兩天后，區(qū)別該菌屬于哪一類缺陷型。 準(zhǔn)確鑒定按上述方法，將初步測定為某一類缺陷型的菌株制成菌懸液，涂布在MM培養(yǎng)基上。在皿底劃分區(qū)域，劃分的區(qū)域數(shù)和需添加的生長因素編組數(shù)相同。按區(qū)域?qū)?yīng)地加入編組混合物。堿基的種類較少，可單一地

17、加入，不必分組。28培養(yǎng)兩天后觀察結(jié)果。 9、 產(chǎn)黑快慢的比較 將鑒定的營養(yǎng)缺陷型菌株與出發(fā)菌株分別在CuTY平板上劃線，比較各個菌株產(chǎn)生黑色素的快慢，置28培養(yǎng)兩天。之后選取高產(chǎn)黑色素的菌株進(jìn)行發(fā)酵。 表1 初測結(jié)果（用“+”表示生長） 菌落編號添加物1234567氨基酸維生素堿 基表2 準(zhǔn)確鑒定結(jié)果 菌落編號菌落生長區(qū)缺陷的營養(yǎng)物質(zhì)12345 發(fā)酵生產(chǎn)黑色素發(fā)酵生產(chǎn)黑色素 現(xiàn)代意義的發(fā)酵主要是利用微生物對周圍環(huán)境極大的適應(yīng)能力、極強(qiáng)的消化能力和繁殖能力等特點(diǎn)，通過發(fā)酵罐大量繁殖微生物來制備所需產(chǎn)品。 發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)流程一般是：保藏斜面活化斜面搖瓶種子種子罐發(fā)酵罐，小型實(shí)驗(yàn)可以略去種子罐一步

18、。 本實(shí)驗(yàn)中主要使用搖瓶進(jìn)行發(fā)酵條件的實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵生產(chǎn)過程中要隨時觀察菌體生長情況。本實(shí)驗(yàn)與生產(chǎn)中菌濃度的測定方法一樣，采用分光光度計(jì)法。 發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基 FW FW發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基： 葡萄糖 2g，(NH4)2SO4 5g， K2HPO4 3g，KH2PO4 3g，NaCl 5g，MgSO4 1g，L-酪氨酸 1g，水1000ml，pH7.0； CuFWCuFW發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基： 在1000ml FW發(fā)酵培養(yǎng)基中加入CuCl2 0.1mM ； TY TY發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基： 葡萄糖 1 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，氯化鈣 0.1 g， 酪氨酸 1 g，水1000

19、ml，pH7.0 CuTY CuTY培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g， CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0 發(fā)酵生產(chǎn)黑色素發(fā)酵生產(chǎn)黑色素實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 1、菌種活化取保藏斜面菌種劃線接種于CuTY平板，28培養(yǎng)24小時。2、種子培養(yǎng) 接一單菌落至裝有5mL液體LB培養(yǎng)基的試管中，28振蕩培養(yǎng)24小時。 3、 發(fā)酵培養(yǎng) 將上述培養(yǎng)液1ml分別接種到四種裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，8層紗布封口，28、200rpm的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。4、取樣每隔24小時取4ml的發(fā)酵液，離心后取上清液用 721

20、型分光光度計(jì)測 OD400值。OD400值表示各實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)黑色素狀況，結(jié)果填入表3。菌體沉淀用4ml的蒸餾水懸浮后測 OD600（菌濃度）。直至培養(yǎng)96小時結(jié)束。 5、 發(fā)酵終止培養(yǎng)至72小時為發(fā)酵終止，進(jìn)行黑色素的測定和提取。比較各種發(fā)酵培養(yǎng)基的異同。黑色素的提取 ：將發(fā)酵液pH調(diào)至 8.0，離心 (3000rpm 20分鐘)去菌體，取上清調(diào) pH至3-4，靜置 l0分鐘，離心 (3000rpm， 20分鐘) 取 黑色沉淀烘干。表3 突變菌株在不同發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)黑色素的變化 培養(yǎng)基FWCuFWTYCuTY24h-OD40048h-OD40072h-OD40096h-OD400黑色素產(chǎn)量（mg

21、/ml）思考題1）你是否獲得了比出發(fā)菌株黑色素產(chǎn)量更高的突變菌株？試分析其可能的原因。2）觀察黑色素產(chǎn)生的時間，并計(jì)算最終黑色素的產(chǎn)量。試分析你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并提出改進(jìn)方案。分分 解解 步步 驟驟 分離產(chǎn)黑色素的細(xì)菌分離產(chǎn)黑色素的細(xì)菌 菌株性質(zhì)鑒定 產(chǎn)黑色素的性質(zhì)觀察挑選菌株所產(chǎn)黑色素的基本性質(zhì)。 菌落特征觀察在篩選平板上產(chǎn)黑色素菌落的特征。 革蘭氏染色顯微鏡觀察革蘭氏染色顯微鏡觀察 誘變育種誘變育種 培養(yǎng)基LBLB培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）：培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）：蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 5g，蒸餾水 1000ml，pH7.0-7.2基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基MMMM：(NH4)2SO4

22、 1g，K2HPO4 7g，KH2PO4 3g，檸檬酸鈉 0.5g，MgSO47H2O 0.1g，葡萄糖 5g，蒸餾水 1000ml，pH自然（7.0）CuTYCuTY培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g， CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0 誘變育種誘變育種準(zhǔn)備工作 1、每組準(zhǔn)備如下器皿： 平皿 至少42個； 玻璃吸管（1ml至少15支，5ml至少12支）；牙簽2包(70 x2)；影印板2個2、第一條桌子的同學(xué)（12人）準(zhǔn)備每組6支裝有4.5ml生理鹽水的試管每組10支裝有5ml LB液體培養(yǎng)基的試管每組

23、200ml LB固體培養(yǎng)基 11-133、第二條桌子的同學(xué)（12人）準(zhǔn)備每組200ml MM固體培養(yǎng)基每組150ml CuTY固體培養(yǎng)基全班共20個組 誘變育種誘變育種實(shí)驗(yàn)步驟 1、制備菌懸液 挑取少許斜面菌種接種于盛有5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，28振蕩培養(yǎng)過夜。2、制作平板將LB固體培養(yǎng)基融化，倒平板，凝固后待用。 11-13實(shí)驗(yàn)完畢請清理桌面！今天第1和2組同學(xué)做清潔。3、 涂平板 取0.1ml 上述菌液放到LB培養(yǎng)基平板上，用無菌玻璃涂棒將菌液均勻地涂滿整個平板表面。 4、 誘變 在上述平板稍靠邊的一個位點(diǎn)上放少許亞硝基胍結(jié)晶，然后將平板倒置于培養(yǎng)箱中28培養(yǎng)24小時。 在放亞硝基

24、胍的位置周圍將出現(xiàn)抑菌圈。 11-14 9:005、 涂布平板 挑取緊靠抑菌圈外側(cè)的少許菌苔到裝有4.5ml生理鹽水的試管中，搖勻，制成處理后菌懸液。 取上述菌懸液0.5ml于盛有4.5ml生理鹽水的試管中，稀釋到10-4。分別取10-1、10-2、10-3和10-4稀釋液涂布LB平板，每個平板涂0.1ml，經(jīng)誘變處理的稀釋液10-1、10-2和10-3每稀釋度涂布3個平板，置28培養(yǎng)兩天。 ( (凡是有亞硝基胍的器皿，都要置于通風(fēng)處用凡是有亞硝基胍的器皿，都要置于通風(fēng)處用1N NaOH1N NaOH溶液溶液浸泡，使殘余的亞硝基胍分解破壞，然后清洗。注意不要浸泡，使殘余的亞硝基胍分解破壞，然后

25、清洗。注意不要讓含有讓含有NGNG的上清液滴在皮膚或衣物上的上清液滴在皮膚或衣物上) ) 11-15 9:00LB平板10個6、營養(yǎng)缺陷型的檢出 點(diǎn)種法 取基本培養(yǎng)基(MM)和完全培養(yǎng)基(CuTY)平板，作好成對與方向的標(biāo)記(即一皿MM和一皿CuTY為一對)，將事先已編號的格子紙分別放在兩培養(yǎng)皿的底部。用無菌牙簽小心地在待測菌落表面挑取少許細(xì)胞，分別點(diǎn)在MM和CuTY培養(yǎng)皿的對應(yīng)位置上(先點(diǎn)MM，后點(diǎn)CuTY)。盡可能多點(diǎn)些菌落。置28培養(yǎng)兩天。 11-17 4:30CuTY和MM平板各2個 影印法 取無菌MM、 CuTY培養(yǎng)基各一皿，在平皿底部畫箭頭作為方向標(biāo)記。選擇一個菌落分散的培養(yǎng)皿作為

26、母平皿，作如上標(biāo)記，并在影印板上也作同樣標(biāo)記。 將母平皿對好標(biāo)記倒放在影印板的絨布上，然后輕輕放下，立即把MM培養(yǎng)皿對好標(biāo)記倒放在影印板下，取下MM培養(yǎng)皿，再印CuTY培養(yǎng)板。 28培養(yǎng)兩天左右。 11-17CuTY和MM平板各2個上述三種方法中，在MM培養(yǎng)基上不長而在LB培養(yǎng)基上生長的菌落可能是缺陷型菌株，需要進(jìn)一步復(fù)證。7、將可能為缺陷型的菌落編號，分別接入5ml LB液體培養(yǎng)基中，28振蕩培養(yǎng)過夜。 11-19 4:305 ml LB液體試管 2支8、營養(yǎng)缺陷型的鑒定 初步鑒定取0.1 ml培養(yǎng)液涂布在MM培養(yǎng)基上。待干后：皿底按圖分成三個區(qū)域，并分別標(biāo)上A(混合氨基酸)，V(混合維生素

27、)和B(堿基混合物)。在每一區(qū)域中央分別對應(yīng)地加入混合氨基酸、混合維生素和堿基混合物。置28培養(yǎng)兩天后，區(qū)別該菌屬于哪一類缺陷型。 11-20 8:00MM平板2個11-20 準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作第三條桌子的同學(xué)（第三條桌子的同學(xué)（1616人）準(zhǔn)備人）準(zhǔn)備每組每組4 4種發(fā)酵培養(yǎng)基各種發(fā)酵培養(yǎng)基各50ml50ml液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 FW FW發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基： 葡萄糖 2g，(NH4)2SO4 5g， K2HPO4 3g，KH2PO4 3g，NaCl 5g，MgSO4 1g，L-酪氨酸 1g，水1000ml，pH7.0； CuFWCuFW發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基： 在1000ml FW發(fā)酵培

28、養(yǎng)基中加入CuCl2 0.1mM ； TY TY發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基： 葡萄糖 1 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，氯化鈣 0.1 g， 酪氨酸 1 g，水1000ml，pH7.0 CuTY CuTY培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g， CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0 準(zhǔn)確鑒定按上述方法，將初步測定為某一類缺陷型的菌株制成菌懸液，涂布在MM培養(yǎng)基上。在皿底劃分區(qū)域，劃分的區(qū)域數(shù)和需添加的生長因素編組數(shù)相同。按區(qū)域?qū)?yīng)地加入編組混合物。堿基的種類較少，可單一地加入，不必分組。28培養(yǎng)3天后觀察結(jié)

29、果。 12-09 4:30MM平板2個9、 產(chǎn)黑快慢的比較 將鑒定的營養(yǎng)缺陷型菌株與出發(fā)菌株分別在CuTY平板上劃線，比較各個菌株產(chǎn)生黑色素的快慢，置28培養(yǎng)3天,每天觀察產(chǎn)黑色素快慢。之后選取高產(chǎn)黑色素的菌株進(jìn)行發(fā)酵。 11-24 4:30CuTY平板2個表1 初測結(jié)果（用“+”表示生長） 菌落編號添加物1234567氨基酸維生素堿 基表2 準(zhǔn)確鑒定結(jié)果 菌落編號菌落生長區(qū)缺陷的營養(yǎng)物質(zhì)12345 發(fā)酵生產(chǎn)黑色素發(fā)酵生產(chǎn)黑色素 現(xiàn)代意義的發(fā)酵主要是利用微生物對周圍環(huán)境極大的適應(yīng)能力、極強(qiáng)的消化能力和極強(qiáng)的繁殖能力等特點(diǎn)，通過發(fā)酵罐大量繁殖微生物來制備所需產(chǎn)品。發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)流程一般是：保藏斜面活化斜面搖瓶種子種子罐發(fā)酵罐，小型實(shí)驗(yàn)可以略去種子罐一步。本實(shí)驗(yàn)中主要使用搖瓶進(jìn)行發(fā)酵條件的實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵生產(chǎn)過程中要隨時觀察菌體生長情況。本實(shí)驗(yàn)與生產(chǎn)中菌濃度的測定方法一樣，采用分光光度計(jì)法。 發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基 FW FW發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基： 葡萄糖 2g，(NH4)2SO4 5g， K2HPO4 3g，KH2PO4 3g，NaCl 5g，