幾種常見染料教學(xué)內(nèi)容

1、幾種常用的染料1. Calcein'k?lse?i：鈣黃綠素（活菌染色）Calcein-AM是一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，Calcein-AM由于在Calcein（鈣黃綠素）的基礎(chǔ)上加強(qiáng)了疏水性，因此能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。當(dāng)其進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)后，酯酶會將其水解為Calcein（鈣黃綠素）留在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和Carboxy-fluoresceindiacetate相比，Calcein-AM是最適合作為熒光探針去染活細(xì)胞的,因為它的細(xì)胞毒性很低。Calcein（鈣黃綠素）不會抑制任何的細(xì)胞功能如增殖或淋巴球的趨化性。另外，使用了Calc

2、ein（鈣黃綠素）的活性檢測的實驗結(jié)果是十分可信并且與標(biāo)準(zhǔn)的51Cr-釋放法所得結(jié)果相一致的。Calcein（鈣黃綠素）的激發(fā)和發(fā)射波長分別為490nm和515nm。Calcein-AM和碘化丙呢（PI）溶液，它們分別可對活細(xì)胞和死細(xì)胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯親脂性很高，使其可透過細(xì)胞膜，通過活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用，Calcein-AM能脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein（鈣黃綠素）能發(fā)出強(qiáng)綠色熒光，因此Calcein-AM僅對活細(xì)胞染色。另一方面，作為核染色染料的PI不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜。它穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（激發(fā)：535n

3、m,發(fā)射：617nm）,因此PI僅對死細(xì)胞染色。由于Calcein（鈣黃綠素）和PI-DNA者W被490nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。用545nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。根據(jù)以上特點，Calcein-AM和碘化丙呢（PI）經(jīng)常被結(jié)合用來作為活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。由于不同細(xì)胞系的最佳染色條件不同，我們建議個別確定Calcein-AM和PI的合適濃度。2. PI:碘化丙呢(只對死細(xì)胞進(jìn)行染色，只結(jié)合死菌，使死菌無法擴(kuò)增)熒光染料PI(碘化丙呢)是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，常用于細(xì)胞凋亡檢測，英文全稱是PropidiumIodide。它是一種澳化乙噬的類似物，在嵌

4、入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色。PI經(jīng)常被用來與Calcein-AM或者FDA等熒光探針一起使用，能同時對活細(xì)胞和死細(xì)胞染色。PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535nm和615nm。3. PMA(只對死細(xì)胞進(jìn)行染色，只結(jié)合死菌，使死菌無法擴(kuò)增)PMA(propidiummonoazide),疊氮澳化丙錠，PMA?是一款具有高親和力的光敏反應(yīng)DNA結(jié)合染料。染料自身的熒光非常微弱，但是結(jié)合核酸后熒光信號很強(qiáng)。PMA傾向于結(jié)合dsDNA,PMA上的疊氮基團(tuán)生成高反應(yīng)性的nitrene基，很容易的在結(jié)合部位與碳?xì)浠衔锊糠值亟Y(jié)合生成穩(wěn)定

5、牢固的共價氮碳鍵，從而形成穩(wěn)定的DNA修飾。PMA完全不能通透細(xì)胞膜，因此它只能選擇性的修飾死細(xì)胞“暴露”的DNA(細(xì)胞壁和細(xì)胞膜已破損的細(xì)胞)。這一特性使得它可以和定量RT-PCR聯(lián)合使用，進(jìn)行選擇性的擴(kuò)增活細(xì)胞DNA,不擴(kuò)增死細(xì)胞DNA。例如，許多細(xì)菌在不良環(huán)境下能進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(Viablebutnonculturablestate,VBNC)。細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)常常造成VBNC狀態(tài)的細(xì)菌漏檢，利用EMA(EthidiumMonoazideBromide)或者PMA(propidiummonoazide)聯(lián)合PCR技術(shù)選擇性抑制細(xì)菌死細(xì)胞擴(kuò)增，該方法結(jié)合了EMA(PMA)選擇滲透性和PC

6、R特異性，作為一種區(qū)分細(xì)胞死活的方法，可以有效檢測細(xì)菌VBNC細(xì)胞。4. EMA(只對死細(xì)胞進(jìn)行染色，只結(jié)合死菌，使死菌無法擴(kuò)增)在食品、藥品、水環(huán)境、醫(yī)療樣品等微生物學(xué)檢驗過程中，傳統(tǒng)PCR技術(shù)無法區(qū)分樣品中的死菌與活菌，因為死菌DNA在PCR檢測中也能擴(kuò)增出目的基因，從而使檢測結(jié)果出現(xiàn)大量的假陽性，干擾了檢測的真實性。疊氮溴化丙錠(PMA)和疊氮澳乙錠(EMA)是一類新型的核酸結(jié)合染料，它們可以穿過受損的細(xì)胞膜或死菌細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與基因組DNA發(fā)生共價交聯(lián)反應(yīng)，從而能阻止樣品中死菌DNA進(jìn)入PCR擴(kuò)增環(huán)節(jié)。而PMA或EMA都不能透過完整未受損的活菌細(xì)胞膜，活菌DNA不受其影響，從而讓樣品中活菌DN