醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科畢業(yè)論文范例-供參考

1、畢業(yè)論文題姓學(xué)系年目:乙肝表抗原的ELISA法定量分析方法學(xué)驗(yàn)證名：張珊號(hào)：別：級(jí)：業(yè):醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)指導(dǎo)教師：二O年十二月目錄中文文獻(xiàn)英文摘要前言錯(cuò)誤!未定義書簽.1 .材料與方法錯(cuò)誤!未定義書簽.1.1 試劑盒1.2 儀器1.3 方法13.2.鋪板方案133.加樣步驟7結(jié)果2A標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍2.2 準(zhǔn)確度(回收率)的驗(yàn)證22.3 精密度的驗(yàn)證2.3.1 板內(nèi)精密度的驗(yàn)證232板間精密度的驗(yàn)證2.4 檢測(cè)限(LOD)計(jì)算53.討論53.1 乙肝外表抗原定量分析的意義53.2 常用定量分析方法633方法概述63.4 方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容63.5 結(jié)果分析及應(yīng)用評(píng)價(jià)7參考文獻(xiàn)7乙肝外表抗原的ELISA法

2、定量分析方法學(xué)驗(yàn)證摘要目的：對(duì)福州藍(lán)圖生物工程生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,以判斷是否能用于臨床樣本分析.方法：ELISA法定量分析,應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8ng/ml做2倍稀釋的6個(gè)濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線,以6,3,1.5ng/ml3個(gè)濃度梯度5復(fù)孔做準(zhǔn)確度,精密度和檢測(cè)限等方法學(xué)驗(yàn)證.結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.997,準(zhǔn)確度97.07%,1.5ng/ml的RSD為16.78%,不滿足ng/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)V15%的要求,檢測(cè)限LOD為0.172ng/ml,低濃度樣品(vl.5ng/ml)的檢測(cè)在準(zhǔn)確性和精密度方面都低于高濃度樣品,不適合低濃度樣品

3、的檢測(cè).結(jié)論：該HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒不能用于臨床標(biāo)本的分析.關(guān)鍵詞乙肝外表抗原ELISA定量分析方法學(xué)驗(yàn)證ThereificationoftheHBsAgELISAquantitativemethodologyAbstractObject:toverifythequantitativemethodologyofFuzhoublueprintbiologicalengineeringcompanytomakesurewhetheritcabeusedtotheanalysisofClinicalSample.Methods：ELISAquantitativemethodolog

4、y,makeanApplicationofthestandardHBsAgkitfromtheconcentrationof8ng/mldo2timesdilutedsixconcentrationgradienttoconstituteastandardcurve,testingWith6,3,1.5ng/ml3aconcentrationgradient5accuratelypreciseanddetection.Results:standardcurve,R2=0.997,theaccuracyofRSDof1.5ng/mis16.78%,theRSDthatcannotmeetthed

5、emandofng/mlbasiclevelislessthan<15%incommon.TheLODis0.172ng/ml,thetestingofLowconcentrationsamples(<1.5ng/ml)arelowerthanhighconcentrationsamplesinbothaccuracyandprecision,whichasaresultmakeitunsuitableforlowconcentrationsampletesting.Conclusion:theELISAquantitativeanalysiskitofHBsAgcannotbeu

6、sedfortheanalysisofClinicalSample.KeywordsHBsAgQuantitativeanalysisVerificationMethodology.前言乙肝病毒感染是我國(guó)最常見的感染性疾病之一,而乙型肝炎血清標(biāo)志物是檢測(cè)乙肝病毒感染最主要的病原標(biāo)志.隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷開展,抗原抗體檢測(cè)靈敏度明顯提升,使低水平乙肝病毒得以檢出,對(duì)臨床診斷及流行病學(xué)有重要意義.ELISA法具有較高靈敏度、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、可進(jìn)行定量和半定量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn),可以在酶免疫分析儀上做批量檢測(cè).目前臨床上多傾向于做定量分析,假設(shè)想知道檢驗(yàn)結(jié)果是否可靠,實(shí)驗(yàn)室那么必須對(duì)所用試劑盒進(jìn)行方法學(xué)

7、驗(yàn)證,本實(shí)驗(yàn)對(duì)福州藍(lán)圖生物工程生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行準(zhǔn)確度,精密度和檢測(cè)限等方法學(xué)驗(yàn)證,現(xiàn)報(bào)告如下.1 .材料與方法1.1 試劑盒乙肝外表抗原ELISA法定量分析試劑盒,福州藍(lán)圖生物工程有限公司出品.1.2 儀黠酶標(biāo)儀：Bio-Rad680；洗板機(jī)：Bio-Rad1575；超純水系統(tǒng)：MilliporeElix；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備；振蕩器(蘇州管械,KJ-201A)；移液器；Tip頭；EP管.13方法13.1. 溶液配置1XPBS緩沖液的配置：稱取8gNaCk0.2gKCK1.44gNa2HPC)4和0.24gKH2P04,溶于800m

8、l蒸儲(chǔ)水中,用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,最后加蒸鏘水定容至1L即可.標(biāo)準(zhǔn)品的配置：原始標(biāo)準(zhǔn)品濃度為8ng/ml.取6個(gè)2rnlEP管,分別標(biāo)記為SI-S6050ul/well,共1孔需50uL每孔配置60ul備用,根據(jù)下表稀釋方案進(jìn)行稀釋.編號(hào)終濃度(ng/ml)預(yù)加1XPBS取剩余(ul)標(biāo)記(ul)S180標(biāo)準(zhǔn)品120S2460S16060S3260S26060S4160S36060S50.560S46060S60.2560S56060質(zhì)控品的配置:50ul/well,共5復(fù)孔需250ul,配置300ul備用,取3個(gè)2mlEP管,分別標(biāo)記為Cl,C2,C3,根據(jù)下表稀釋方案進(jìn)行稀釋.

9、編號(hào)終濃度(ng/ml)預(yù)加IXPBS取剩余(ul)標(biāo)記(ul)C16150標(biāo)準(zhǔn)品450C23300C1300300C31.5300C230030013.2. 鋪板方案取出試劑盒中已包被酶標(biāo)板,取出板條,根據(jù)下表鋪板方案進(jìn)行鋪板在相應(yīng)孔中依次參加系列標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及空白對(duì)照,每孔50ul.空白對(duì)照參加1XPBS緩沖液.12345AS1ClC2C3PBSBS2ClC2C3PBSCS3ClC2C3DS4ClC2PBSES5ClC3PBSFS6C2C3PBS133.加樣步驟參加酶標(biāo)抗體,50ul/welb震蕩.37電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育60min,取出后洗板4次,參加A、B液,50ul/weH,37c電

10、熱恒溫培養(yǎng)箱溫育15min.參加終止液,50ul/wello酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀,蓋上蓋子,在電腦上翻開MicroplateManager5.2軟件,選擇450nm波長(zhǎng)參照波長(zhǎng)630nm,設(shè)置LAYOUT和報(bào)告模式,測(cè)定各孔吸收值.2.結(jié)果2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度對(duì)應(yīng)的實(shí)測(cè)OD值HBsAg(ng/ml)X4210.50.25OD1.661.000.620.390.310.270.0H_I_I_I_I_I_I_I_I_i0123456789ConcngZml以HBsAg理論濃度為橫坐標(biāo),所測(cè)OD值為縱坐標(biāo)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察線性關(guān)系,結(jié)果顯示R2=0.9973,顯示具有良好的相關(guān)性

11、y=0.1816X+0.2307R2=0.99732.2 準(zhǔn)確度回收率的驗(yàn)證質(zhì)控品理論稀釋濃度對(duì)應(yīng)實(shí)測(cè)濃度值HBsAs(ng/ml)測(cè)定值1234566.244.565.736.096.4033.363.293.553.283.481.51.241.271.171.171.20質(zhì)控品做了3個(gè)濃度梯度,每個(gè)濃度做了5個(gè)復(fù)孔,下表是對(duì)每個(gè)濃度梯度進(jìn)行準(zhǔn)確度(回收率)的驗(yàn)證.HBsAg(ng/ml)測(cè)定值(ng/ml)回收率()平均回收率RR(%)3個(gè)濃度的平均回收率66.24103.9397.5897.07%4.5675.925.7395.576.09101.456.40106.6033.3611

12、2.13113.073.29109.573.55118.403.28109.403.48115.831.51.2482.4780.561.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93結(jié)果顯示HBsAg6ng/ml和3ng/ml的平均回收率為97.58%,113.07%,滿足限度要求在85%-115%的范圍內(nèi),而HBsAg1.5ng/ml的平均回收率為80.56%,滿足方法定量限在80%-120%的范圍內(nèi).3個(gè)濃度梯度的平均回收率為97.7%,顯示準(zhǔn)確性好.2.3精密度的驗(yàn)證2.3.1板內(nèi)精密度的驗(yàn)證HBsAg(ng/ml)測(cè)定值X±sRSD(%)1234566

13、.244.565.736.096.405.80±0.7412.7333.363.293.553.283.483.39±0.123.501.51.241.271.171.171.201.21±0.043.69上表中RSD(%)這一參數(shù)表示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,也就是變異系數(shù)CV值,HBsAg6ng/ml的5個(gè)復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%,顯示孔間差異較大,精密度不高,但是也符合ng/ml級(jí)RSD水平的一般應(yīng)15%的要求,其中有一孔濃度為4.55,與其它孔比擬差異較大,可能是由于操作引起例如加樣不準(zhǔn).而3ng/ml,和1.5ng/ml的變異系數(shù)CV為3.5%,3.7%,

14、符合顯示孔間重復(fù)性好,符合ng/ml級(jí)RSD水平的一般應(yīng)15%的要求,精密度高.232板間精密度的驗(yàn)證從同一實(shí)驗(yàn)室中獲取2組同樣的數(shù)據(jù),做板間精密度的驗(yàn)證.首先對(duì)同一實(shí)驗(yàn)條件下不同實(shí)驗(yàn)人員所獲得的數(shù)據(jù)是否可用于板間分析做驗(yàn)證.(ao)8ueq-osqv5050522110組組-第第R2=0.967R2=0.991HBsAg(ng/ml)S42I0.50.25第二組OD值1.981.420.860.580.400.31第三組OD值1.310.770.360.170.090.03以HBsAg理論濃度為橫坐標(biāo),所測(cè)OD值為縱坐標(biāo)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察線性關(guān)系.O.O+C-I0123456789Con

15、c(ngZml)以上標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示第二組數(shù)據(jù)的R2=0.967,第三組數(shù)據(jù)R2=0.991.第二組數(shù)據(jù)由于有一些孔與標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離較大,但考慮到隨機(jī)抽樣與均數(shù)存在一定誤差,還是可以用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.下表對(duì)3組數(shù)據(jù)做板間分析.HBsAg(ng/ml)測(cè)定值x±sRSD(%)I234566.236.105.994.555.785.395.736.086.346.086.646.496.396.845.966.04±0.559.1033.363.362.593.282.932.713.553.532.813.283.072.493.472.992.523.06±0.371

16、2.061.51.241.461.191.271.51.241.171.731.251.16l.7ll.2l1.191.76l.ll1.34±0.2316.78從表中3個(gè)組的數(shù)據(jù)比擬可知,HBsAg6ng/ml和3ng/ml的RSD分別為9.10%,12.06%,滿足對(duì)ng/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)15%的要求,精密度高.而HBsAg1.5ng/ml的RSD為16.78%,不滿足ng/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)15%的要求,顯示低濃度的孔間重復(fù)性差,精密度不是很高,故以下對(duì)HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的三組數(shù)據(jù)做分析.對(duì)HBsAg理論濃度為L(zhǎng)5ng/ml的準(zhǔn)確性,精密度分析HB

17、sAg(ng/ml)測(cè)定值ng/ml回收率平均回收率RR%SD%CV%第一組數(shù)據(jù)1.5ng/ml1.2482.4780.562.983.701.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93第二組數(shù)據(jù)1.5ng/ml1.4697.60109.19.498.701.50100.001.73115.601.72114.531.77117.67第三組數(shù)據(jù)1.5ng/ml1.1979.4780.273.804.741.2583.131.2583.531.2281.071.1174.13從上表可知笫一組數(shù)據(jù)和第三組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性差,精密度高.而第二組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高,而精密度相對(duì)于笫一組和

18、笫三組數(shù)據(jù)要好.綜上對(duì)于HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的這一低濃度梯度的板內(nèi)準(zhǔn)確性和板間精密度相對(duì)于高濃度的線性要差一些.2.4檢測(cè)限LOD計(jì)算LOD為取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標(biāo)準(zhǔn)差.12345MeanSDLOD空白孔OD值0.1580.1530.160.1620.170.160.006220.172山上表可知,LOD為0.172.檢測(cè)限LOD表示分析方法檢測(cè)低濃度樣品的能力,也稱為方法的靈敏度,LOD通常為標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn),要求標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)應(yīng)LOD,此標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度點(diǎn)為0.25,大于LOD0.172,故此標(biāo)準(zhǔn)曲線線性好.3.討論3.1 乙肝外表抗原定量分析的意義

19、乙肝外表抗原是乙肝兩對(duì)半的其中一項(xiàng),乙肝兩對(duì)半定性檢測(cè)對(duì)乙肝疾病的診斷,病情監(jiān)測(cè),療效觀察起到了一定的作用.但隨著臨床醫(yī)學(xué)的開展,乙肝兩對(duì)半定性檢測(cè)已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床及患者的要求,特別是在療效觀察以及乙肝疫苗注射后抗體產(chǎn)生情況的觀察上有明顯的缺乏.隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的開展,乙肝兩對(duì)半定量測(cè)定成為可行,大大彌補(bǔ)了乙肝兩對(duì)半定性檢測(cè)的缺乏.而且乙肝兩對(duì)半定量檢測(cè)可與HBVDNA熒光測(cè)定相互補(bǔ)充,綜合評(píng)價(jià)患者病情與藥物療效,為低含量的慢性乙肝、病毒攜帶者提供了正確判斷病情的依據(jù)這在目前的臨床治療中應(yīng)用十分廣泛.3.2 常用定量分析方法此次實(shí)驗(yàn)只是對(duì)一種試劑盒的可用性進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,而目前常用的定量方法已

20、有很多,如TRFIA,TRFIA法乂稱解離增強(qiáng)錮系熒光免疫分析,是近十年發(fā)展起來(lái)的一種微量分析方法.此技術(shù)集酶標(biāo)記、同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一身,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好,且測(cè)定范圍更寬,試劑盒貨架壽命長(zhǎng),操作簡(jiǎn)便和非放射性等特點(diǎn),成為最有潛力的一種標(biāo)記免疫分析方法.全自動(dòng)酶免分析儀目前也廣泛應(yīng)有,自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的操作手段使實(shí)驗(yàn)到達(dá)了全過程控制和全過程標(biāo)準(zhǔn)化分析,大大提升了實(shí)驗(yàn)的精密度,使檢測(cè)結(jié)果更趨穩(wěn)定,從而保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性.3.3 方法概述目前普遍使用的HBsAg試劑盡管在制備時(shí)采用了高親和力的單克隆抗體,并且使包被抗體、酶標(biāo)抗體的結(jié)合位點(diǎn)盡可能的遠(yuǎn).以防止競(jìng)爭(zhēng)抑制,最大程度地

21、解決鉤狀效應(yīng)(HOOK)的問題.本次實(shí)驗(yàn)是對(duì)實(shí)驗(yàn)室的一種試劑盒,即福州藍(lán)圖生物工程生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,以判斷是否能用于臨床樣本分析.試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn).往預(yù)先包被HBsAg捕獲抗體的包被微孔中,依次參加標(biāo)本,標(biāo)準(zhǔn)品,HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,經(jīng)過溫育并徹底洗滌.川底物TMB顯色,TMB在過氧化物的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色,并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色.顏色的深淺和樣品中得HBsaAg呈正相關(guān).用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度OD值,計(jì)算樣品濃度.應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8,4,2,1,0.5,0.25ng/ml6個(gè)濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)

22、曲線,以6,3,L5ng/ml3個(gè)濃度梯度5復(fù)孔做質(zhì)控,進(jìn)行準(zhǔn)確度,精密度和檢測(cè)限等方法學(xué)驗(yàn)證.選擇最低濃度為0.25ng/ml的原因是由于,絕大多數(shù)HBV感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg,含量在5ng/ml600ug/ml之間,高者可達(dá)2000ug/ml以上,滿足了現(xiàn)階段文獻(xiàn)報(bào)道的最低濃度值.3-4方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容一般包括標(biāo)準(zhǔn)曲線,準(zhǔn)確度,精密度和檢測(cè)限.標(biāo)準(zhǔn)曲線亦稱校正曲線,系指生物樣品中所測(cè)定的樣品濃度與響應(yīng)的相關(guān)性,通常用回歸分析方法所得的回歸方程來(lái)評(píng)件,此實(shí)驗(yàn)所用了6個(gè)濃度點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.方法準(zhǔn)確度指待測(cè)濃度與真實(shí)濃度的接近值了,一般用相對(duì)回收率表示,限度要求在85%115

23、%的范圍內(nèi).精密度那么表示分析方法的可重復(fù)性,是對(duì)同一樣品每次測(cè)定結(jié)果的一致性,用標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,可做板內(nèi)和板間的驗(yàn)證,對(duì)于ug/ml級(jí)水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差一般應(yīng)<10%ng/ml級(jí)水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差一般應(yīng)<15%.檢測(cè)限那么表示分析低濃度樣品的水平,通常乂稱為靈敏度.3.4 5結(jié)果分析及應(yīng)用評(píng)價(jià)第一組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=Q9973,顯示具有良好的相關(guān)性,HBsAg濃度為6ng/ml和3ng/ml的回收率分別為為97.58%,符合113.07%,符合限度要求在85%115%的范圍內(nèi).但是HBsAg濃度為5ng/ml的回收率為80.56%,顯示此試劑盒對(duì)于低濃度樣品的檢測(cè)準(zhǔn)確度差.在精密度方面,6,3,1.5ng/ml變異系數(shù)CV分別為12.73%,3.69%,3.50%,而HBsAg6ng/ml的5個(gè)復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%,顯示孔間差異較大,精密度不高,但是也符合ng/ml級(jí)RSD水平的一般應(yīng)15%的要求,其中有一孔濃度為4.55,與其它孔比擬差異較大,可能是