MCAO模型的制備

1、實驗前準備實驗器材：干棉球、酒精棉球、75%酒精、生理鹽水、注射器（1ml、2ml）、黑色記號筆、固定大鼠用粗線繩、大鼠板、染色小燒杯、標本瓶手術器械：備皮剪子1、眼科剪 1、大直鑷 1 只、小彎鑷 1 對、（動脈夾 2）、止血鉗 2-3、縫合線、縫合針、持針器麻醉劑： 10%水合氯醛（ 400mg/kg）保溫： 60W 白熾燈，于 37cm 高處直接照射能使肛溫保持在37栓線：直徑 0.24mm，頭端光滑圓鈍；在栓線18mm 的位置用黑色記號筆標記；75%酒精清潔后置 1: 2500 單位肝素化生理鹽水中備用。體重與栓線直徑：直徑0.24mm 的栓線適用于體重220-280g 的 SD 大鼠

2、。TTC 的配制：用 0.2mol/L 磷酸緩沖液（ PBS）配成 2%TTC 溶液（ pH7.4），避光保存。藥物配制：無論生理鹽水還是受試藥物標簽均采用代號，給藥及評分均采用單盲。儀器激光多普勒血流儀（Laser Doppler Flowmetry, LDF ）系統(tǒng)，包括：PeriFlux 5001Main Unit ，PF5010 LDPM Unit（激光多普勒微血流灌注量檢測單元），LD Probe407-1（ Perimed Co., Jarfalla, Sweden）；大鼠腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；牙科手鉆（Strong 90#, Korea）；大鼠腦切片模具；

3、熒光正置顯微鏡 (NIKONECLIPSE 80i, ×400)及成像系統(tǒng)（ACT-2UNIKONImagingSystem）。大腦中動脈栓塞（ MCAO ）模型的制備參照 Zea Longa等2 建立的大鼠大腦中動脈內栓線阻斷方法，作適當改進。10 %水合氯醛溶液 400mg/kg，腹腔注射麻醉動物。 大鼠仰臥位固定， 頸部正中切開皮膚，鈍性分離各層組織，暴露右側頸總動脈(CCA) 。分離至頸內動脈（ internal carotid artery ， ICA ）、頸外動脈（ external carotid artery，ECA ）分叉后一段，仔細分離避免損傷迷走神經和氣管，置線

4、備用。于頸內、頸總動脈處用動脈夾夾閉， 頸外動脈近心端及遠心端結扎， 中間剪斷。將頸外動脈游離端拉至與頸內動脈成一條直線，將尼龍線由頸外動脈插入，插入后用 0號絲線結扎，以防止出血，打開頸內動脈處動脈夾，將尼龍線插入頸內動脈，繼續(xù)插入至顱內， 插入深度約 18.5 ±0.5mm至微感阻力， 使尼龍線頭端通過 MCA 起始處，到達較細的大腦前動脈，此時即實現右側大腦中動脈的血流阻塞，結扎 ICA 以固定尼龍線和防止出血， 逐層縫合，尼龍線殘端留 l cm 長于皮外。假手術組只進行術前麻醉和血管分離術， 不結扎及導入線栓。 手術過程中室溫保持在 24-25，生物機能實驗系統(tǒng)進行動物呼吸及

5、心電監(jiān)測。3局部腦血流量測定大鼠俯臥位固定于立體定位儀上， 開顱窗并清理手術視野， 以前囟為坐標原點，選取前囟后 1-2mm、右側 2-4mm為測定點 9 ，周圍直徑約 2-3mm 區(qū)域用牙科鉆打薄，保持硬腦膜的完整并避開較大的血管，定位并固定好探頭座。將動物從定位儀取下并使其仰臥位于手術臺上，進行MCAO 手術，當線插入 ICA 后先不插入顱內，穩(wěn)定 LDF 讀數后，記錄 5min 內血流值，以其平均值作為腦血流的基礎值（ baseline value）。把線插入顱內，當血流值突然下降至基礎值的 10%-20 % 時，提示中腦動脈血流已被阻斷。每組 MCAO 前的血流值為本組的基礎值（ 10

6、0），手術后血流值均以此基礎值的百分率表示。4神經行為學檢查Bederson 評s分動物于給藥前及處死前進行神經行為學觀察，參照Zea Longa的方法，提鼠尾離開地面約 1 尺，觀察兩前肢狀況；將大鼠置于水平地面，推動其雙肩，觀察兩側抵抗力有無差異；大鼠置于地面，觀察其行走情況。采用四級評分法（ 0-5 分），分數越高，說明其神經行為損傷越嚴重。（ 1）行為完全正常者，記 0分；（ 2）提起鼠尾離開地面，手術對側前肢內旋、內收者，記1分；（ 3）大鼠至地面，用手擠壓兩側檢查其抗力，手術對側抗力下降者，記2分；（ 4）大鼠至地面，觀察其行走，圍繞手術對側轉圈者，記3分；（ 5）損傷極其嚴重，已無法自主活動者，記 4分。5腦梗死體積的測定：評分后大鼠斷頭處死，迅速將取出的腦組織置于 -20冰箱， 10min 后置室溫環(huán)境，將腦置于大鼠腦切片模具中， 切除嗅球、 小腦和低位腦干后按圖譜所示間隔 2mm冠狀切五刀，切成 6個大腦連續(xù)冠狀粗切片。然后迅速將腦片置于 5ml含 2%TTC的溶液中， 37恒溫、避光孵育 30min，期間每隔 5min將腦片翻動一次。經 TTC染色后，正常組織呈玫瑰紅色，梗死組織未被染色而呈白色。將每組腦片排列整齊，拍