溶菌酶檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)

1、1 術(shù)語(yǔ)和定義溶菌酶酶活性單位：在25C、pH值為6.2的條件下，于450nm處每分鐘引起溶酶小球菌體（MicrococcusLysodeiktidus）溶液吸光度下降0.001所需要的酶量為一個(gè)酶活性單位U。本定義適合“比濁法”。溶菌酶效價(jià)：溶菌酶在一定濃度范圍內(nèi)，其對(duì)數(shù)計(jì)量與抑菌圈直徑（面積）呈對(duì)數(shù)關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)其對(duì)微生物的抑制作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與樣品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計(jì)算出樣品的效價(jià)，單位為uo本定義適合“管碟法”。2 技術(shù)要求2.1 外觀和性狀要求粉酶為白色或微黃色的結(jié)晶或無(wú)定形粉末。2.2 技術(shù)指標(biāo)4.2.1 粉酶水分含量：12%。4.2.2 粉酶粒度：420血徑分析篩篩上物W4%4.

2、2.3 粉酶熾灼殘?jiān)?0.0%。4.2.4 酶活（效價(jià)）指標(biāo)表1產(chǎn)品成分分析保證值項(xiàng)目指標(biāo)粉X犬50型溶菌酶酶活性（效價(jià)），）U/g（u）5000004.2.5 衛(wèi)生指標(biāo)符合GB13078和NY/T722的有關(guān)規(guī)定。3試驗(yàn)方法本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑和水，在沒(méi)有注明其他要求時(shí)，均指分析純?cè)噭┖虶B/T6682中規(guī)定的三級(jí)水，所用試液中的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在沒(méi)有注明其他要求時(shí)均要求按GB/T601,GB/T602制備。3.1 外觀的測(cè)定取樣品少許放入燒杯，下襯白紙進(jìn)行目測(cè)。3.2 粉酶水分的測(cè)定按GB/T6435規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)。3.3 粉酶粒度的測(cè)定按GB/T5917規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)。3.4 粉酶熾灼殘?jiān)臏y(cè)定按中國(guó)

3、獸藥典規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)。3.5 衛(wèi)生指標(biāo)的測(cè)定按飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB13078和NY/T722規(guī)定的方法進(jìn)行。3.6 溶菌酶酶活性(效價(jià))的測(cè)定溶菌酶微生物測(cè)定法系在適宜條件下，通過(guò)檢測(cè)溶菌酶對(duì)微生物的抑制作用，計(jì)算出溶菌酶活性(效價(jià))的方法。依據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理不同，可分為比濁法和瓊脂擴(kuò)散法(即管碟法)。3.6.1 試劑和溶液5.6.1.1 溶酶小球菌(MicrococcusLysodeiktidus)將溶酶小球菌接種于固體培養(yǎng)基上，置37培養(yǎng)48小時(shí)，用無(wú)菌水將菌體洗下，用紗布濾過(guò)，濾液離心后，傾去上層清液，用水洗滌菌體數(shù)次，然后用少量水懸浮，冰凍干燥，得淡黃色粉末，供測(cè)定用，保存一年。使用時(shí)，在營(yíng)養(yǎng)

4、瓊脂斜面上活化，傳代培養(yǎng)，工作用菌種不超過(guò)5代，斜面菌種從培養(yǎng)好到使用時(shí)間，最長(zhǎng)不超過(guò)2個(gè)月。并將培養(yǎng)好的斜面菌種，放置4冰箱保存。制備的菌懸液可以使用一周，不用時(shí)放置4冰箱保存。5.6.1.2 磷酸緩沖液稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O)11.7g,磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O)7.86g，加900mL水溶解,調(diào)pH值至6.2，定容至1000mL。5.6.1.3 10氫氧化鈉溶液5.6.1.4 1硫酸銅溶液5.6.1.5 30%三氯醋酸5.6.1.6 斜面培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂5.6.1.7 抗生素檢定培養(yǎng)基II號(hào)5.6.1.8 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品5.6.1.9 儀器5.6.2.1 分

5、析天平：精密度0.1mg；5.6.2.2 牛津杯：牛津杯內(nèi)徑6.0±0.1mm,外徑7.8±0.1mm,高10.0±0.1mm,每套牛津杯的重量差異不超過(guò)±0.05g，內(nèi)外壁及兩端面光滑平坦。管壁厚薄一致；5.6.2.3 陶瓦蓋：內(nèi)徑約103mm外徑108mm平坦，吸水性強(qiáng)。應(yīng)定期清洗、干燥或干熱滅菌；5.6.2.4 游標(biāo)卡尺：精度0.02mm；5.6.2.5 雙碟：內(nèi)徑約90mm外徑16mmr17mmi勺硬質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，碟底厚薄均勻，水平透明，無(wú)色斑氣泡；5.6.2.6 超凈工作臺(tái)：有效工作面局部潔凈度100級(jí)。用于試驗(yàn)菌的接種傳代或菌懸液制備

6、；5.6.2.7 pH酸度計(jì)：精確到0.01;5.6.2.8 分光光度計(jì)：配10mm比色皿，可在450nm下測(cè)定吸光值；5.6.2.9 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速為4000r/min以上；5.6.2.10 秒表：每小時(shí)誤差不超過(guò)5s；5.6.2.11 恒溫培養(yǎng)箱：設(shè)置漂移溫度為35c37C;5.6.2.12 高壓滅菌鍋5.6.2.13 烘箱5.6.2.14 其它玻璃器皿：刻度吸管：1mL,2mL5mL10mL,25mL無(wú)菌吸管等；3.6.3試驗(yàn)方法5.6.3.1 鑒另1J固體樣品：取本品10mg,溶于1mL水中，加30%三氯醋酸2滴，產(chǎn)生白色沉淀。取試管一支，加5%溶菌酶水溶液2滴、10%氫氧化鈉5滴及1%

7、硫酸銅溶液1滴，混勻后，應(yīng)顯紫玫瑰色。5.6.3.2 方法一：比濁法特定濃度的溶酶小球菌懸浮液在450nm條件下存在一定吸光度，溶酶菌作用于溶酶小球菌底物會(huì)引起吸光度降低，通過(guò)計(jì)算指定時(shí)間內(nèi)吸光度降低的幅度可以計(jì)算出溶菌酶的活力。試驗(yàn)步驟：精確稱取樣品（液體樣品需在離心機(jī)上以3500r/min離心10min后取上清液）不少于20mg,用pH6.2的0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋到酶活單位為100U/mL200U/mL,備用。將保存好的溶酶小球菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上活化，傳代兩次后的菌體37c培養(yǎng)48小時(shí)，再用生理鹽水從培養(yǎng)基上洗脫下來(lái)，并稀釋到一定倍數(shù)，使其在25c時(shí)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定的吸光

8、度A。為0.650.75之間。精密取底物懸浮液2.5mL,放入比色杯中，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，作為零時(shí)讀數(shù)，然后取1¥品溶液0.5mL,加入比色杯中，用秒表開(kāi)始計(jì)時(shí)，迅速混合，以磷酸緩沖液做空白，到60秒時(shí)記下吸光度A60、。試樣酶活力的計(jì)算：1000Xd=X（A0-A60）XNX2（1）M式（1）中：Xd待測(cè)樣品的溶菌酶活力，U/g（或mL）Ao0秒時(shí)的吸光度A6060秒時(shí)的吸光度M一樣品質(zhì)量，g（或mL）LN一樣品總的稀釋倍數(shù)5.6.3.3 方法二：管碟法利用溶菌酶的抗菌性質(zhì)及其溶液在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，將未知效價(jià)的樣品液與已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一條件下，在攤布高

9、度敏感性特定試驗(yàn)菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行一定時(shí)間的對(duì)照培養(yǎng)，溶菌酶溶液在培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散到達(dá)適當(dāng)范圍內(nèi)時(shí)就產(chǎn)生了抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的透明抑菌圈，并且在一定的溶菌酶濃度范圍內(nèi)，溶菌酶對(duì)數(shù)濃度與抑菌圈直徑成正比。經(jīng)比較標(biāo)準(zhǔn)液與樣品兩者抑菌圈直徑或面積大小，采用二劑量法，即可推算出樣品的效價(jià)。菌懸液的制備：將保存好的溶酶小球菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上活化，傳代兩次后的菌體37c培養(yǎng)48小時(shí)，再用10mL生理鹽水將一支培養(yǎng)好的溶酶小球菌斜面菌體洗下制成菌懸液，盡量保證每次所加指示菌的濃度一樣，供測(cè)定用。測(cè)定平板的制備：底層：用滅菌破口移液管（25mL）,吸取已融化的培養(yǎng)基20mL注入雙碟內(nèi)，等凝固后更換干燥的陶瓦蓋。菌層：

10、取出溶酶小球菌菌懸液，按1%的菌量添加，吸取菌懸液加入已融化冷卻至50C55c的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻作為菌層用。用滅菌10mL破口移液管，吸取菌層培養(yǎng)基5mL,使均勻分布在底層培養(yǎng)基上，置水平臺(tái)上，用陶瓦蓋覆蓋，放置40min,待凝固，備用。待測(cè)酶液的準(zhǔn)備：精確稱取樣品（液體樣品需在離心機(jī)上以3500r/min離心10min后取上清液）不少于20mg,用pH6.2的0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋到酶活單位在5000U/mL左右，備用。標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的滴加：取8個(gè)雙碟，在每個(gè)雙碟中對(duì)稱放入4個(gè)牛津杯，分別成對(duì)角滴加標(biāo)準(zhǔn)品高（SH）、標(biāo)準(zhǔn)品低（SL）及樣品高（TH）、樣品低（TL）兩種濃度的溶液，直至牛津

11、杯口平滿。注意滴加溶液間隔不可過(guò)長(zhǎng)，因溶液的擴(kuò)散時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響。（注意：標(biāo)準(zhǔn)品必須現(xiàn)配現(xiàn)用，不能隔夜。從測(cè)定平板的制備到進(jìn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，整個(gè)過(guò)程必須在2小時(shí)內(nèi)完成）。雙碟的培養(yǎng)及抑菌圈的測(cè)量將雙碟置于37±0.5C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16小時(shí)18小時(shí)后，取出雙碟，測(cè)定抑菌圈直徑（如有破圈或不完整的抑菌圈，則應(yīng)舍棄該碟）。樣品的高低劑量透明圈直徑盡量和標(biāo)準(zhǔn)品的高低劑量透明圈直徑接近，整個(gè)系統(tǒng)的透明圈直徑控制在15mm19mm之間。結(jié)果判定：微生物測(cè)定結(jié)果的正確性和精密度受很多因素影響，為了使測(cè)定結(jié)果更能真實(shí)的反映客觀情況，符合設(shè)計(jì)原理，就必須將測(cè)定結(jié)果按生物檢定統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)及效價(jià)計(jì)算和可信限計(jì)算。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析按藥典附錄的生物檢定統(tǒng)計(jì)法進(jìn)行F的顯著性測(cè)驗(yàn)，要求直線回歸和劑間要非常顯著（P<0.01）,偏離平行不應(yīng)顯著（P>0.05）;且可信限率不得超過(guò)5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在可靠性成立前提下，方可根據(jù)設(shè)計(jì)的計(jì)算公式進(jìn)行樣品效價(jià)計(jì)算。將樣品的估計(jì)效價(jià)控制在實(shí)際效價(jià)的90%110%,否則，需要重新估計(jì)效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。R =log 1T2 Ti -S2 -Si2_1 2- I 100%T2 S -Ti -Si(2)Pt=RxAt（3）式中：R: