脫氫表雄酮對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎大鼠細(xì)胞免疫的影響

1、脫氫表雄酮對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎大鼠細(xì)胞免疫的影響        【摘要】  目的: 探討脫氫表雄酮（DHEA）對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎（EAN）大鼠細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響。方法:21只Lewis大鼠隨機(jī)分為DHEA 0.5 mg組、 2 mg治療組和對照組, 治療組于注射牛周圍神經(jīng)髓磷脂（BPM）抗原乳劑后第5天開始每日皮下注射DHEA, 對照組皮下注射相同體積的DHEA溶媒。疾病高峰期檢查坐骨神經(jīng)IFN、 TNF陽性反應(yīng)細(xì)胞, 檢測引流淋巴結(jié)和脾臟單個核細(xì)胞增殖反應(yīng), 檢測培養(yǎng)上清TNF、 IFN、 I

2、L10含量。結(jié)果: 兩種劑量DHEA治療組均能減少坐骨神經(jīng)IFN、 TNF陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目(P<0.05), 抑制BPM刺激T淋巴細(xì)胞增殖(P<0.05), 降低培養(yǎng)上清中IFN、 TNF水平(P<0.05)。各組間 IL10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論: DHEA可抑制EAN大鼠自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞增殖和促炎性細(xì)胞因子過度表達(dá), 抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)。 【關(guān)鍵詞】  脫氫表雄酮 神經(jīng)炎 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性 細(xì)胞免疫脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone, DHEA）是3種腎上腺皮質(zhì)類固醇之一, 是雌激素和雄激素的前體物質(zhì), 也是目前

3、尚不明確的多種免疫調(diào)節(jié)性類固醇的前體物質(zhì)。體內(nèi)、 外研究證實(shí)DHEA及其代謝產(chǎn)物具有抗炎、 抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性, 對人和動物的免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生有益的作用1。DHEA能改善病毒、 細(xì)菌或其他感染實(shí)驗(yàn)動物的存活率2; 塵螨誘導(dǎo)的變應(yīng)性氣道疾病小鼠服用DHEA, 可降低支氣管灌洗液中嗜酸細(xì)胞數(shù)目, 降低IL4、 IL5、 IFN和IgE水平3; 超生理濃度的DHEA可抑制T細(xì)胞受體介導(dǎo)的體外T淋巴細(xì)胞增殖, 使KLH致敏脾臟細(xì)胞IL4生成增加、 IFN水平下降4; 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者服用DHEA治療, 表現(xiàn)出明顯的病情改善, 對糖皮質(zhì)激素治療需求量減少5。上述研究提示DHEA影響細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。

4、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎（experimental autoimmune neuritis, EAN）是CD4+ T細(xì)胞介導(dǎo)的外周神經(jīng)自身免疫性脫髓鞘疾病, 是公認(rèn)的研究格林巴利綜合征（GBS）的經(jīng)典動物模型, 目前國內(nèi)外尚未見有DHEA影響EAN免疫反應(yīng)的報(bào)道?；谝酝w內(nèi)外研究證實(shí)的DHEA對免疫系統(tǒng)的作用, 我們應(yīng)用DHEA干預(yù)發(fā)病初期EAN大鼠, 觀察對細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響, 以探討治療GBS的新方法。1  材料和方法1.1  材料  DHEA、 二甲基亞砜、 弗氏不完全佐劑均購自SigmaAldrich公司; H37Ra株熱滅活結(jié)核桿菌、 植物血凝素（PHA

5、）購自Difco公司; 免疫組化用一抗購自RD公司, 二抗購自Invitrogen公司; Ficocl淋巴細(xì)胞分離液、 RPMI1640培養(yǎng)液、 胎牛血清均購自Gibco公司; 3H甲基胸腺嘧啶核苷購自原子能研究所; 酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自Bender MedSystem, Inc公司。超速離心法自牛脊神經(jīng)根提取周圍神經(jīng)髓磷脂（bovine peripheral myelin,  BPM）; Lewis大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。1.2  方法2  結(jié)果2.1  DHEA減少外周神經(jīng)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生  應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測EAN高

6、峰期大鼠坐骨神經(jīng)中IFN、 TNF表達(dá), 結(jié)果顯示 DHEA 2 mg治療組和0.5 mg治療組IFN、 TNF陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)均較對照組明顯減少(P<0.05 ), DHEA 2 mg 治療組與0.5 mg治療組比較IFN、 TNF陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)未見明顯差異（表1, 圖1、 2）。表1  坐骨神經(jīng)細(xì)胞因子陽性細(xì)胞數(shù)（個/mm2組織）（略）Tab 1  Numbers of cytokineexpressing cells per mm2 sciatic nerve sectionsaP<0.05  vs control group.圖1  坐

7、骨神經(jīng)IFN表達(dá)（略）Fig 1  IFNexpressing cells in sciatic nerve sectionsA: Control group; B: DHEA 0.5 mg/day; C: DHEA 2 mg/day.圖2  坐骨神經(jīng)TNF表達(dá)（略）Fig  2  TNFexpressing cells in sciatic  nerve sectionsA: Control group; B: DHEA 0.5 mg/day; C: DHEA 2 mg/day.2.2  DHEA抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)  于

8、EAN高峰期檢測大鼠引流淋巴結(jié)和脾臟單個核細(xì)胞增殖。與對照組比較, DHEA 2 mg治療組和0.5 mg治療組均能明顯抑制BPM和PHA誘導(dǎo)的單個核細(xì)胞增殖(P<0.05 ); PBS(無抗原刺激)組單個核細(xì)胞培養(yǎng)顯示DHEA 2 mg治療組對單個核細(xì)胞增殖有明顯抑制作用(P<0.05), 0.5 mg治療組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。表2  淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)（略）Tab 2  T cell proliferation in vitro (cpm)aP<0.05  vs control group.2.3  DHEA影響單個

9、核細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平  應(yīng)用ELISA檢測引流淋巴結(jié)和脾臟單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN、 TNF、 IL10水平。結(jié)果顯示, 與對照組比較, DHEA 2 mg治療組和0.5 mg治療組均能減少IFN和TNF生成(P<0.05), DHEA 2 mg治療組IFN和TNF水平較0.5 mg 治療組降低(P<0.05); 各組間 IL10水平未顯示明顯的差異（表3）。表3  BPM刺激單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子水平比較（略）Tab 3  Levels of cytokine production by BPMrestimulated  sp

10、leen cell supernatantsaP<0.05vs control group.3  討論    DHEA是人體內(nèi)含量最豐富的類固醇, 已有許多研究證實(shí)DHEA或其代謝產(chǎn)物可調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡, 可能對自身免疫性疾病有治療作用6, 7。EAN是由外周神經(jīng)髓磷脂或其蛋白質(zhì)成分主動免疫或通過過繼轉(zhuǎn)移外周神經(jīng)抗原特異性T細(xì)胞在易感嚙齒類動物誘導(dǎo)的, 是CD4+ T細(xì)胞介導(dǎo)的外周神經(jīng)自身免疫性脫髓鞘疾病。我們應(yīng)用DHEA干預(yù)發(fā)病初期EAN（免疫后炎癥階段）, 結(jié)果顯示, DHEA 0.5 mg/劑和2 mg/劑兩種劑量均能抑制BPM

11、誘導(dǎo)的單個核細(xì)胞增殖, 減少病灶局部及BPM刺激后單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN、 TNF產(chǎn)生, 提示DHEA可抑制細(xì)胞免疫反應(yīng), 抑制Th1細(xì)胞功能。Du等6應(yīng)用DHEA治療SJL/J 小鼠過繼轉(zhuǎn)移性EAE, 可阻止病情進(jìn)展, 降低脊髓促炎性細(xì)胞因子IFN、 IL12p40、 TNF、 iNOSmRNA表達(dá)。Offner等8應(yīng)用人工合成的DHEA衍生物HE2200和DHEA代謝產(chǎn)物HE2500預(yù)防性治療SJL小鼠EAE, 兩者均可減輕疾病嚴(yán)重程度, 降低血漿中PLP特異性抗體水平, 抑制PLP誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖, 降低脊髓中TNF、 TNF、 IFN、 MIP1、 MCP1 mRNA表達(dá)。上述研究

12、與我們的結(jié)論一致。    外周神經(jīng)內(nèi)膜下T淋巴細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞浸潤及多灶性、 節(jié)段性髓鞘脫失是EAN的主要病理改變, 促炎細(xì)胞因子（IFN、 TNF、 IL12、 NO等）在發(fā)病機(jī)制中起重要作用。外周神經(jīng)內(nèi)膜下浸潤的T淋巴細(xì)胞釋放IFN激活巨噬細(xì)胞, 后者通過吞噬作用和釋放炎性細(xì)胞因子（如TNF）, 直接損傷神經(jīng)髓鞘。有證據(jù)表明, IFN在血清、 外周淋巴組織和周圍神經(jīng)中的水平與EAN臨床癥狀相平行, IFN缺失小鼠抵抗EAN的發(fā)生9。TNF被認(rèn)為在免疫介導(dǎo)的髓鞘脫失中起直接作用,  向大鼠坐骨神經(jīng)中注射TNF, 導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)膜血管壁淋巴細(xì)胞聚積, 髓鞘脫

13、失, 軸索變性10。提示IFN和TNF在EAN發(fā)病中的關(guān)鍵作用。本研究顯示, DHEA可降低全身和病灶局部IFN、 TNF水平, 對IL10產(chǎn)生無影響。推測DHEA對EAN的治療作用主要是下調(diào)Th1反應(yīng), 抑制促炎性細(xì)胞因子過度分泌, 對Th2細(xì)胞因子水平無影響。    我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 與0.5 mg/劑治療組比較, 2 mg/劑治療組能明顯減少單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN、 TNF產(chǎn)生, 提示DHEA對免疫功能的影響存在劑量相關(guān)性。    細(xì)胞因子生成過多是以Th1/Th2為基礎(chǔ)的免疫失調(diào)的中心環(huán)節(jié), 如何糾正機(jī)體的免疫失調(diào), 是

14、目前治療自身免疫性疾病所面臨的關(guān)鍵問題。雖然DHEA及其代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞功能中的確切作用尚存在爭議11, 但是上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 該類分子是促炎性細(xì)胞因子過度表達(dá)的抑制劑, 可能對T淋巴細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生作用, 有希望成為治療自身免疫性疾病的一種新手段。 【】  1 von Mühlen D, Laughlin GA, KritzSilverstein D, et al. The Dehydroepiandrosterone And WellNess (DAWN) study: research design and methods

15、J. Contemp Clin Trials, 2007, 28(2): 153-168.2 Oberbeck R, Dahlweid M, Koch R, et al. Dehydroepiandrosterone decreases mortality rate and improves cellular immune function during polymicrobial sepsisJ. Crit Care Med, 2001, 29(2): 380-384. 3 Yu CK, Yang BC, Lei HY, et al. Attenuation of house dust mi

16、te Dermatophagoides farinaeinduced airway allergic responses in mice by dehydroepiandrosterone is correlated with downregulation of TH2 responseJ. Clin Exp Allergy, 1999, 29(3): 414-422.4 Du C, Guan Q, Khalil MW, et al. Stimulation of Th2 response by high doses of dehydroepiandrosterone in KLHprimed

17、 splenocytesJ. Exp Biol Med (Maywood), 2001, 226(11): 1051-1060.5 van Vollenhoven RF. Dehydroepiandrosterone for the treatment of systemic lupus erythematosusJ. Expert Opin Pharmacother, 2002, 3(1): 23-31.6 Du C, Khalil MW, Sriram S. Administration of dehydroepiandrosterone suppresses experimental a

18、llergic encephalomyelitis in SJL/J miceJ. J Immunol, 2001, 167(12): 7094-7101.7 Duan RS, Link H, Xiao BG. Dehydroepiandrosterone therapy ameliorates experimental autoimmune myasthenia gravis in Lewis ratsJ. J Clin Immunol, 2003, 23(2): 100-106.8 Offner H, Zamora A , Drought H , et al. A synthetic an

19、drostene derivative and a natural androstene metabolite inhibit relapsingremitting EAEJ. J Neuroimmunol, 2002, 130(1-2): 128-139.9 Zhu Y, Ljunggren HG, Mix E, et al. Suppression of autoimmune neuritis in IFNgamma receptordeficient miceJ. Exp Neurol, 2001, 169(2): 472-478.10 Weishaupt A, Brück W

20、, Hartung T, et al. Schwann cell apoptosis in experimental autoimmune neuritis of the Lewis rat and the functional role of tumor necrosis factoralphaJ. Neurosci Lett, 2001, 306(1-2): 77-80.11 Dillon JS. Dehydroepiandrosterone, dehydroepiandrosterone sulfate and related steroids: their role in inflam

21、matory, allergic and immunological disordersJ. Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2005, 4(3): 377-385.1         表2  淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)（略）Tab 2  T cell proliferation in vitro (cpm)aP<0.05  vs control group.2.3  DHEA影響單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平  應(yīng)用ELIS

22、A檢測引流淋巴結(jié)和脾臟單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN、 TNF、 IL10水平。結(jié)果顯示, 與對照組比較, DHEA 2 mg組和0.5 mg治療組均能減少IFN和TNF生成(P<0.05), DHEA 2 mg治療組IFN和TNF水平較0.5 mg 治療組降低(P<0.05); 各組間 IL10水平未顯示明顯的差異（表3）。表3  BPM刺激單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子水平比較（略）Tab 3  Levels of cytokine production by BPMrestimulated  spleen cell supernatantsaP<0

23、.05vs control group.3  討論    DHEA是人體內(nèi)含量最豐富的類固醇, 已有許多研究證實(shí)DHEA或其代謝產(chǎn)物可調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡, 可能對自身免疫性疾病有治療作用6, 7。EAN是由外周神經(jīng)髓磷脂或其蛋白質(zhì)成分主動免疫或通過過繼轉(zhuǎn)移外周神經(jīng)抗原特異性T細(xì)胞在易感嚙齒類動物誘導(dǎo)的, 是CD4+ T細(xì)胞介導(dǎo)的外周神經(jīng)自身免疫性脫髓鞘疾病。我們應(yīng)用DHEA干預(yù)發(fā)病初期EAN（免疫后炎癥階段）, 結(jié)果顯示, DHEA 0.5 mg/劑和2 mg/劑兩種劑量均能抑制BPM誘導(dǎo)的單個核細(xì)胞增殖, 減少病灶局部及BPM刺激后單個核細(xì)

24、胞培養(yǎng)上清IFN、 TNF產(chǎn)生, 提示DHEA可抑制細(xì)胞免疫反應(yīng), 抑制Th1細(xì)胞功能。Du等6應(yīng)用DHEA治療SJL/J 小鼠過繼轉(zhuǎn)移性EAE, 可阻止病情進(jìn)展, 降低脊髓促炎性細(xì)胞因子IFN、 IL12p40、 TNF、 iNOSmRNA表達(dá)。Offner等8應(yīng)用人工合成的DHEA衍生物HE2200和DHEA代謝產(chǎn)物HE2500預(yù)防性治療SJL小鼠EAE, 兩者均可減輕疾病嚴(yán)重程度, 降低血漿中PLP特異性抗體水平, 抑制PLP誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖, 降低脊髓中TNF、 TNF、 IFN、 MIP1、 MCP1 mRNA表達(dá)。上述研究與我們的結(jié)論一致。    外

25、周神經(jīng)內(nèi)膜下T淋巴細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞浸潤及多灶性、 節(jié)段性髓鞘脫失是EAN的主要病理改變, 促炎細(xì)胞因子（IFN、 TNF、 IL12、 NO等）在發(fā)病機(jī)制中起重要作用。外周神經(jīng)內(nèi)膜下浸潤的T淋巴細(xì)胞釋放IFN激活巨噬細(xì)胞, 后者通過吞噬作用和釋放炎性細(xì)胞因子（如TNF）, 直接損傷神經(jīng)髓鞘。有證據(jù)表明, IFN在血清、 外周淋巴組織和周圍神經(jīng)中的水平與EAN臨床癥狀相平行, IFN缺失小鼠抵抗EAN的發(fā)生9。TNF被認(rèn)為在免疫介導(dǎo)的髓鞘脫失中起直接作用,  向大鼠坐骨神經(jīng)中注射TNF, 導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)膜血管壁淋巴細(xì)胞聚積, 髓鞘脫失, 軸索變性10。提示IFN和TNF在EAN發(fā)病中的關(guān)鍵

26、作用。本研究顯示, DHEA可降低全身和病灶局部IFN、 TNF水平, 對IL10產(chǎn)生無影響。推測DHEA對EAN的治療作用主要是下調(diào)Th1反應(yīng), 抑制促炎性細(xì)胞因子過度分泌, 對Th2細(xì)胞因子水平無影響。    我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 與0.5 mg/劑治療組比較, 2 mg/劑治療組能明顯減少單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN、 TNF產(chǎn)生, 提示DHEA對免疫功能的影響存在劑量相關(guān)性。    細(xì)胞因子生成過多是以Th1/Th2為基礎(chǔ)的免疫失調(diào)的中心環(huán)節(jié), 如何糾正機(jī)體的免疫失調(diào), 是目前治療自身免疫性疾病所面臨的關(guān)鍵問題。雖然DHEA及其代

27、謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞功能中的確切作用尚存在爭議11, 但是上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 該類分子是促炎性細(xì)胞因子過度表達(dá)的抑制劑, 可能對T淋巴細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生作用, 有希望成為治療自身免疫性疾病的一種新手段。 【】  1 von Mühlen D, Laughlin GA, KritzSilverstein D, et al. The Dehydroepiandrosterone And WellNess (DAWN) study: research design and methodsJ. Contemp Clin Trials, 2007,

28、 28(2): 153-168.2 Oberbeck R, Dahlweid M, Koch R, et al. Dehydroepiandrosterone decreases mortality rate and improves cellular immune function during polymicrobial sepsisJ. Crit Care Med, 2001, 29(2): 380-384. 3 Yu CK, Yang BC, Lei HY, et al. Attenuation of house dust mite Dermatophagoides farinaeinduced airway allergic responses in mice by dehydroepiandrosterone is correlated with downregulation of TH2 responseJ. Clin Exp Allergy, 1999, 29(3): 414-422.4 Du C, Guan Q, Khalil MW, et al. Sti