表皮生長因子對晶體上皮細(xì)胞增殖影響的研究

1、表皮生長因子對晶體上皮細(xì)胞增殖影響的研究【摘要】目的評價(jià)表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF) 對晶體上皮細(xì)胞增殖的影響。方法在培養(yǎng)的牛和人晶體上皮細(xì)胞中添加EGF,甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法測定細(xì)胞增殖情況以及抗EGF受體(EGF receptor, EGFR)抗體對EGF作用的影響。結(jié)果EGF濃度為10-1102 g/L對牛眼晶體上皮細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，其中濃度為10 g/L作用3天達(dá)到最大促增殖效果；EGF濃度為1102 g/L 對人晶體上皮細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，濃度為102 g/L具有最大促增殖效

2、果。抗EGFR抗體濃度0.5 mg/L時(shí)特異性阻斷EGF對人晶體上皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，濃度為3 mg/L時(shí)阻斷率達(dá)81。結(jié)論EGF可促進(jìn)晶體上皮細(xì)胞增殖，并提示人晶體上皮細(xì)胞表面存在特異性 EGFR，EGF與其受體結(jié)合后可促進(jìn)細(xì)胞增殖，對白內(nèi)障術(shù)后后囊混濁的發(fā)生發(fā)揮作用?！娟P(guān)鍵詞】晶體上皮細(xì)胞生長因子Effect of epidermal growth factor on proliferation of lens epithelial cellsWANG Juan, LI Xiaorong, ZHANG Xiaohong, et al. International Intraocular

3、Implant Training Center, Tianjin Medical University, Tianjin 300070【Abstract】ObjectiveTo study the effect of epidermal growth factor (EGF) on lens epithelial cells (LECs). MethodsBovine LECs (bLECS) and human LECs (hLECs) in culture were treated with EGF. Then, MTT assay was used to examine the prol

4、iferation of the cells and the effect of anti-EGF receptor (EGFR) antibody. ResultsBLECs showed marked proliferation depending on the concentration of EGF from 10-1102 g/L, and EGF at a concentration of 10 g/L on day 3 induced the highest increase of proliferation; EGF promoted proliferation of hLEC

5、s at the concentration of 1102 g/L and EGF of 102 g/L showed the highest promotive effect on proliferation. The anti-EGFR antibody blocked the promotive effect of EGF on proliferation of hLECs when the concentration of this antibody was as low as 0.5 mg/L, and the blocking rate was 81% at the concen

6、tration of 3 mg/L. ConclusionsEGF has a promotive effect on proliferation of LECs. It is suggested that there are specific EGFRs on the surface of hLECs. EGFs bound to their receptors stimulate proliferation of LECs and play an important role in occurrence and development of posterior capsular opaci

7、fication after cataract surgery.【Key words】LensEpithelial cellsGrowth factor后囊混濁是白內(nèi)障囊外摘除術(shù)后影響視功能的主要并發(fā)癥之一，其發(fā)生與殘留的晶體上皮細(xì)胞增殖有關(guān)1。研究影響晶體上皮細(xì)胞增殖的因素對于深入探討后囊混濁的發(fā)病機(jī)制及防治有重要意義。我們在體外培養(yǎng)牛和人晶體上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，觀察表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF) 對晶體上皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，并通過抗EGF受體（EGF receptor,EGFR)抗體阻斷EGF的促細(xì)胞增殖作用闡明其作用機(jī)制。材料與方法一、牛和人晶體上

8、皮細(xì)胞培養(yǎng)采用新鮮牛眼，清除眼球周圍組織，消毒后于無菌條件下分離晶體前囊膜，加入含10胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液，吹打囊膜使細(xì)胞簇散落。將培養(yǎng)皿置于37、5CO2孵箱中，培養(yǎng)1周后，3或4天更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞生長發(fā)生融合時(shí)，用0.2胰蛋白酶溶液消化后傳代培養(yǎng)。人晶體上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)來自白內(nèi)障術(shù)中環(huán)形撕囊取出的晶體前囊膜，患者為先天性白內(nèi)障，年齡520歲，性別及眼別隨機(jī)。培養(yǎng)液為含20胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，避免吹打囊膜，培養(yǎng)條件及傳代方法同牛眼晶體上皮細(xì)胞。二、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)測定法100 l細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中

9、培養(yǎng)至所需時(shí)間后，加入10 l MTT試劑（終濃度為0.5 g/L），培養(yǎng)4 h(37)，加入100 l二甲基亞砜溶液，室溫下靜置5 min，采用酶標(biāo)儀490 nm波長比色測定。吸光度(A)值與活細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)。三、EGF對牛眼晶體上皮細(xì)胞增殖的作用取第2代已融合的牛眼晶體上皮細(xì)胞，以無血清DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 l,細(xì)胞濃度為5107個(gè)/L。加入EGF，使其終濃度分別為10-2、10-1、1、10、102 g/L。培養(yǎng)后第3天 MTT法測定不同濃度EGF對細(xì)胞增殖的影響。選擇促進(jìn)牛眼晶體上皮細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)的EGF濃度，于培養(yǎng)后第15天分別測定細(xì)胞增殖情

10、況。四、EGF對人晶體上皮細(xì)胞增殖的作用方法同牛眼晶體上皮細(xì)胞。96孔培養(yǎng)板每孔加細(xì)胞懸液100 l，濃度為1107個(gè)/L，含5%胎牛血清，EGF終濃度分別為10-1、1、10、102、103 g/L。培養(yǎng)后第3天MTT法測定細(xì)胞增殖情況。五、抗EGFR抗體阻斷EGF對人晶體上皮細(xì)胞增殖的作用人晶體上皮細(xì)胞懸液100 l加于96孔培養(yǎng)板，濃度為1107個(gè)/L，含5%胎牛血清，并加入抗EGFR抗體，使其終濃度分別為0.1、0.5、1、2、3 mg/L。然后置于5% CO2孵箱37下預(yù)孵育30 min，加入EGF，濃度為促進(jìn)人晶體上皮細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)的濃度。培養(yǎng)后第3天MTT法測定細(xì)胞增殖情況。六

11、、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每份標(biāo)本平行測定3個(gè)孔，求其平均值(s)，各組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果一、牛和人晶體上皮細(xì)胞培養(yǎng)牛眼晶體上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)后24 h囊膜片貼附于皿底，散在細(xì)胞簇也已貼壁，48 h細(xì)胞單層貼壁生長。細(xì)胞呈扁平的不規(guī)則多邊形，胞質(zhì)透明，核為圓形、色暗。細(xì)胞增長至1或2周時(shí)融合傳代（1，2）。人晶體上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)后4872 h囊膜片貼附于皿底。與牛眼晶體上皮細(xì)胞比較，細(xì)胞生長緩慢，胞體較小，胞質(zhì)更為透明，細(xì)胞核較不明顯（3，4）。二、EGF對晶體上皮細(xì)胞增殖的作用1.EGF濃度為10-1102 g/L對牛眼晶體上皮細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用(P0.05)，其中濃度為10 g/L作用3天達(dá)到最大促

12、增殖效果。不同濃度EGF的增殖促進(jìn)效果(添加因子組/未添加因子組)100。EGF作用不同時(shí)間的增殖促進(jìn)效果（添加因子組/培養(yǎng)后第1天未添加因子組）100。其中培養(yǎng)后第1天未添加因子組A值為 0.2800.010（表1，2)。表1不同濃度EGF對牛眼晶體上皮細(xì)胞增殖的作用EGF濃度(g/L)吸光度值(s)增殖促進(jìn)效果(%)t值00.2230.01910-20.2740.0211182.50810-10.3170.036*1363.57410.5350.018*23019.987100.6060.023*26021.6581020.4310.026*18510.651*P0.05*P0.001 表

13、2EGF作用不同時(shí)間對牛眼晶體上皮細(xì)胞增殖的影響EGF作用 時(shí)間(d)吸光度值(s)增殖促進(jìn)效果(%)t值10.2890.0141030.90620.5140.031*18412.44430.6120.020*21925.72240.3460.029*1243.72750.3100.011*1113.497*P0.001*P0.05 2.EGF濃度為1102 g/L對人晶體上皮細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用(P0.01)，濃度為102 g/L具有最大促增殖效果。增殖促進(jìn)效果（添加因子組/未添加因子組）100（表3）。表3不同濃度EGF對人晶體上皮細(xì)胞增殖的作用EGF濃度(g/L)吸光度值(s)增殖促進(jìn)效果

14、(%)t值00.0460.01210-10.0630.0131371.66510.1000.007*2176.734100.1070.010*2336.7651020.1190.016*2596.3231030.0360.009781.155*P0.5 mg/L時(shí)有效(P0.05)，濃度為3 mg/L時(shí)阻斷率達(dá)81。阻斷率（添加因子未被抗體封閉組-添加因子抗體封閉組）/（添加因子未被抗體封閉組-未添加因子未被抗體封閉組）100。其中未添加因子未被抗體封閉組的A值為0.0640.012（表4）。表4抗EGFR抗體對mEGF促細(xì)胞增殖作用的阻斷抗EGFR抗體濃度(mg/L)吸光度值(s)對EGF作

15、用的阻斷率(%)t值00.1480.0110.10.1410.01380.7120.50.1150.009*394.02310.1020.015*554.28420.0850.008*758.02730.0800.010*817.926*P0.05*P0.5 mg/L時(shí)特異性阻斷EGF的作用，濃度為3 mg/L時(shí)阻斷率達(dá)81%。從而間接證實(shí)了人晶體上皮細(xì)胞表面存在特異性EGFR，EGF與其受體結(jié)合后發(fā)揮促細(xì)胞增殖作用。生長因子與經(jīng)典的多肽激素不同，一般不通過內(nèi)分泌方式，而主要通過旁分泌或自分泌的方式起作用。因此我們推斷白內(nèi)障囊外摘除術(shù)中，由于注吸皮質(zhì)等機(jī)械性操作，造成晶體上皮細(xì)胞的損傷，術(shù)后殘

16、留的晶體上皮細(xì)胞即引起損傷修復(fù)過程，合成釋放EGF，其釋放可能是修復(fù)過程中動員生長因子的一種快速途徑。釋放的EGF 及晶體中存在的EGF 與晶體上皮細(xì)胞表面特異性EGFR結(jié)合，促進(jìn)晶體上皮細(xì)胞的增殖、移行和分化，并可能成為后囊混濁的原因之一。由此可以設(shè)想，以抗EGFR 抗體阻斷EGF的促細(xì)胞增殖作用，在一定程度上可以抑制白內(nèi)障術(shù)后后囊混濁的發(fā)生。作者單位：300070 天津醫(yī)科大學(xué)世界人工晶體中國天津培訓(xùn)中心王娟（研究生，現(xiàn)在天津眼科醫(yī)院，300020）參考文獻(xiàn)1McDonnell PJ, Zarbin MA, Green WR. Posterior capsule opacification

17、 in pseudophakic eyes. Ophthalmology,1983,90:1548-1553.2Mayer U. Untersuchungen zur Atmug an ?berlebendem Linsenepithel. Ber Dtsch Ophthalmol Ges Heidelberg,1969,70:359-361.3Reddy VN, Lin LR, Giblin FJ, et al. The efficacy of aldose reductase inhibitors on polyol accumulation in human lens and retin

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