鹿茸多肽對β淀粉樣蛋白誘導脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的保護作用

1、鹿茸多肽對淀粉樣蛋白誘導脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的保護作用 作者：王旭凱 王英 楊有庚 冷向陽【摘要】 目的探討鹿茸多肽對淀粉樣蛋白誘導脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的保護作用。方法體外進行胎鼠脊髓神經(jīng)元細胞培養(yǎng)傳代，細胞進入對數(shù)生長期后進行實驗。MTT比色法檢測不同濃度淀粉樣蛋白作用24 h后細胞活力變化；檢測25molL 淀粉樣蛋白作用24 h后，細胞凋亡百分數(shù)和觀察細胞caspase3表達情況。結(jié)果不同濃度的淀粉樣蛋白作用24 h后對細胞活力均明顯下降，并呈劑量依賴性(P0.05)；鹿茸多肽可明顯抑制淀粉樣蛋白誘導的脊髓神經(jīng)元細胞凋亡現(xiàn)象(P0.05)，且可使caspase3的表達量下降。結(jié)論鹿茸多肽通過

2、抑制淀粉樣蛋白誘導脊髓神經(jīng)元細胞caspase3表達增高而對其細胞凋亡發(fā)揮保護作用，本實驗為探索新的脊髓神經(jīng)損傷的藥物提供了重要的理論基礎。 【關(guān)鍵詞】 鹿茸多肽 脊髓神經(jīng)細胞 細胞凋亡 淀粉樣蛋白 casepase3脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是外科常見的創(chuàng)傷，其年發(fā)病率逐年升高。在脊髓損傷中，除了原發(fā)的物理打擊因素造成神經(jīng)細胞損傷外，已發(fā)現(xiàn)損傷區(qū)及臨近部位的神經(jīng)細胞存在遲發(fā)性的死亡現(xiàn)象，這種死亡與常見的壞死不同1，表現(xiàn)為一種程序性死亡（細胞凋亡），細胞凋亡可能參與了脊髓損傷的病理生理過程。caspase3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，降低其的表達有助于脊髓損傷的修

3、復和再生2。鹿茸系鹿科動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生絨毛的幼角3。關(guān)于鹿茸多肽混合物，近兩年，有學者通過實驗證明鹿茸多肽對脊髓損傷后的神經(jīng)細胞有保護作用4，本實驗應用鹿茸多肽作用于淀粉樣蛋白誘導的脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的保護作用，以進一步闡述其對脊髓神經(jīng)細胞保護作用的機理。1 實驗材料與方法1.1 實驗材料 15d孕鼠購自吉林大學實驗動物中心；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自invitrogen公司；細胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板購自Castar公司；神經(jīng)生長因子（NGF）購自Sigma公司；鹿茸多肽由長春中醫(yī)藥大學惠贈；淀粉樣蛋白(A25-35)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自

4、(Sigma公司)；兔多克隆caspase3抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.2 實驗方法1.3 統(tǒng)計方法 應用統(tǒng)計分析軟件SPSS14.0分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差(xs)表示，兩兩比較采用t檢驗，P0.05，有統(tǒng)計學意義。1 2 結(jié)果2.1 脊髓神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)及鑒定 單細胞懸液接種后第2d，細胞聚集成團狀，第3d出現(xiàn)大量懸浮的neurosphere(約3060個細胞)，而且neurosphere越來越多。到第7d細胞胞體十分飽滿，輪廓清晰，有的細胞可見明顯的鳥眼狀細胞核，也有的細胞伸出樹枝狀突起，突起相互連成。用神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)標記神經(jīng)元。鏡下觀察，可見實驗組細胞胞體

5、飽滿，突起明顯并連成網(wǎng)狀。見圖1。圖1 烯醇化酶(NSE)標記神經(jīng)元（略）2.2 MTT比色法檢測細胞活力 MTT檢測結(jié)果顯示，不同濃度的A25-35（0、5、10、20、25、30molL)作用24h后，均可引起細胞活力下降，并呈一定的劑量依賴性(P0.05)。本實驗選擇A25-35 25mol /ml劑量進行后續(xù)實驗，見圖2。圖2 MTT法檢測A25-35細胞活力的影響（略）表1 鹿茸多肽對A誘導脊髓細胞凋亡的抑制作用（略）圖3 鹿茸多肽對A誘導脊髓細胞凋亡的抑制作用（略）2.4 免疫組化檢測caspase3結(jié)果 caspase3陽性細胞胞質(zhì)著棕色。結(jié)果顯示：對照組無caspase3陽性染

6、色的細胞；A（25molL）+鹿茸多肽（400mg/ml）組caspase3陽性細胞數(shù)減少，比單純A（25molL）組少，其作用與NGF陽性對照組比較無差異，鹿茸多肽對脊髓細胞凋亡具有抑制作用。見圖4。a 對照組b A組（25molL）c A（25molL）+鹿茸多肽（400mg/ml）d A（25molL）+NGF（20ng/ml）圖4 鹿茸多肽對A（25M）誘導脊髓神經(jīng)元細胞caspase3的表達的影響（略）3 討論 脊髓損傷的是神經(jīng)領(lǐng)域內(nèi)一道尚未解決的難題，雖然人們采取了許多種方法促進損傷后的脊髓軸突再生修復，但存在許多限制因素，很難達到理想效果，許多學者進行了深入研究脊髓神經(jīng)組織損傷后

7、再生不良，其重要原因是傷后繼發(fā)性損害不斷加重所致，而細胞凋亡是繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵，抑制細胞凋亡是阻止或減少繼發(fā)性損傷，保護神經(jīng)功能的治療所在。細胞凋亡相關(guān)基因包括：Caspases（半胱氨酸蛋白酶基因家族）、bcl2（B細胞淋巴瘤/白血病基因家族2）、p53等。Caspases家族對細胞，特別是神經(jīng)元凋亡程序的啟動具有核心作用。它直接水解激活與DNA斷裂等凋亡特征性改變密切相關(guān)的蛋白，又稱為死亡蛋白酶。迄今已發(fā)現(xiàn)14個家族成員，其中caspase3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的必經(jīng)之路5。因此抑制caspase3的表達是成為探索的治療途徑

8、之一。淀粉樣蛋白是淀粉樣前體蛋白(APP)通過一定降解途徑產(chǎn)生的6，其主要的活性片段為A25-35，A25-35可誘導細胞凋亡，本實驗利用輻射誘導脊髓神經(jīng)細胞凋亡，觀察鹿茸多肽對脊髓神經(jīng)細胞凋亡后caspase3表達的影響。 本實驗結(jié)果顯示：應用A25-35誘導胎鼠脊髓神經(jīng)元細胞凋亡后，在細胞中加400mg/ml鹿茸多肽后，通過MTT比色法檢測細胞活力、流式細胞儀檢測細胞凋亡數(shù)目和免疫組化觀察caspase3表達量下降，提示，鹿茸多肽具有抑制A25-35誘導脊髓神經(jīng)細胞凋亡的作用，其作用是通過調(diào)控凋亡基因的表達，即caspase3表達下調(diào)而實現(xiàn)的。本實驗說明，鹿茸多肽主要是通過有效地降低死亡蛋

9、白酶caspase3的表達量，進而抑制脊髓神經(jīng)元細胞的凋亡起到保護脊髓神經(jīng)元細胞的作用?！尽?1 Emery E, Aldana P, Bunge MB, et al. Apoptosis after traumatic human spinal cord injuryJ.Journal Of Neuosurgery,1998, 89(6): 911920.2 Springer JE,Azbill RD,Knapp PE, Activation of the caspase3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injuryJ. Nature Medicine,1999, 5（8): 943946.3 王本祥,周秋麗.鹿茸的化學、藥理及臨床研究進展J. 藥學學報,1991, 26(9) : 714720.4 冷向陽.鹿茸多肽對輻射誘導脊髓神經(jīng)細胞凋亡的保護作用J.實驗診斷學,2007,11(3):319321.5 Daigle I, Simon HU.Critical role for caspases3 and8 in neutrophil but not eosino