抑癌基因在肺癌治療中的新進(jìn)展

1、抑癌基因在肺癌治療中的新進(jìn)展                 肺癌是當(dāng)前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年升高。由于大多數(shù)肺癌患者臨床確診時已屬晚期，其中50%以上患者不能手術(shù)，而絕大部分非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者（占肺癌的75%80%，包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌等）對現(xiàn)行放療和化療又不夠敏感，因此肺癌的治療成為臨床治療一大難題。近來人們研究的熱點(diǎn)集中到肺癌的基因治療上，并取得了許多重要進(jìn)展?，F(xiàn)主要對肺癌的基因治療方法之一棗抑

2、癌基因治療肺癌的研究新進(jìn)展作一綜述。 一、抑癌基因及其與細(xì)胞周期關(guān)系 抑癌基因（tumor suppressor gene）指正常細(xì)胞內(nèi)存在的，能抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生的一類基因群，當(dāng)它們受到各種因子的作用失活后，細(xì)胞的生長分化失控，增加了細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的可能性。目前已分離克隆的抑癌基因有Rb、p53、p16、p33ING1、nm23、TIMP、KAI1、APH、MCC、APC、DCC、BRCA1等，最近被認(rèn)為候選抑癌基因的有FHIT、PTEN/MMAC1/TEP1等。 Rb基因又名成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因, 是最早發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因, 定位于人染色體13q14上，編碼的一組DNA結(jié)合蛋白與細(xì)胞分化的

3、過程有關(guān)，具有抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因目前認(rèn)為是p53基因，該基因定位于17p13.1, 編碼的核磷酸蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活的作用，正常的p53基因具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，且DNA損傷后可觸發(fā)細(xì)胞凋亡，防止惡變。近幾年來發(fā)現(xiàn)的p16基因即多腫瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1, MTS1) ，定位于人類多種惡性腫瘤頻繁發(fā)生缺失的染色體區(qū)域9p21，p16表達(dá)產(chǎn)物的基本功能是作為細(xì)胞周期素依賴激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)抑制蛋白。 新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因p33ING1，定位于染色體11q33，需依賴于野生

4、型p53，才能發(fā)揮細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)。而定位在人染色體5q21的抑癌基因MCC、APC在肺癌中經(jīng)常表現(xiàn)為純合性缺失，在小細(xì)胞肺癌（SCLC) 細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，抑癌基因APH、MCC、APC的表達(dá)低下，提示它們可能與SCLC的形成有關(guān)。nm23、TIMP、KAI1基因的作用是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。DCC（結(jié)直腸癌缺失基因）是在結(jié)腸癌中新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。 BRCA1抑癌基因主要與家族性乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。FHIT基因定位于人染色體3p14.2，與肺癌、乳腺癌、腸癌、胰腺癌等有關(guān)，染色體3p是乳腺癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤的經(jīng)常缺失區(qū)，抑癌基因APH也位于3p區(qū)（3p21.3）。PTEN/MMAC1/TEP

5、1基因定位于人染色體10q23，在肺癌 抑癌基因在肺癌治療中的新進(jìn)展 發(fā)現(xiàn)有突變。 抑癌基因的抑癌功能主要是通過在細(xì)胞增殖周期對細(xì)胞分裂和生長進(jìn)行負(fù)調(diào)控，防止細(xì)胞周期失控變成無限制地增殖而實(shí)現(xiàn)的。 細(xì)胞周期中有兩個重要的調(diào)節(jié)點(diǎn)，即G1-S和G2-M調(diào)節(jié)點(diǎn)。細(xì)胞周期的運(yùn)行主要依賴于細(xì)胞周期依賴性激酶（CDK），該酶只有與細(xì)胞周期素（cyclins）結(jié)合才有活性，可促進(jìn)細(xì)胞周期中G1S和G2M的轉(zhuǎn)變。在細(xì)胞周期素中最有意義的是細(xì)胞周期蛋白D（cyclin D），它能激活CDK2、4、5，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，進(jìn)行DNA合成。 目前認(rèn)為p53、p16、Rb基因與G1-S調(diào)節(jié)點(diǎn)有關(guān)。p53基因的表

6、達(dá)產(chǎn)物p53蛋白的作用機(jī)制主要是間接作用于細(xì)胞周期，p53可促進(jìn)P21蛋白（CDK2的抑制劑）的表達(dá)，從而在細(xì)胞周期中抑制G1期至S期的轉(zhuǎn)換，阻礙細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，使細(xì)胞分裂和生長受到抑制。而p16具有直接的細(xì)胞生長抑制效應(yīng)，p16與細(xì)胞周期蛋白D競爭同CDK4的結(jié)合，當(dāng)p16與CDK4結(jié)合后，CDK4/cyclin復(fù)合物活性受到抑制，細(xì)胞分裂生長受阻。CDK/cyclin復(fù)合物對Rb蛋白具有磷酸化作用，Rb被磷酸化后其G1期停滯作用喪失，而Rb非磷酸化時可阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。 p53基因較為特殊，與G2-M調(diào)節(jié)點(diǎn)又有一定關(guān)系，是參與細(xì)胞凋亡的重要基因。野生型p53基因使細(xì)胞在離子輻

7、射、藥物刺激引起DNA損傷后停留在G1期進(jìn)行修復(fù)，若DNA修復(fù)失敗，細(xì)胞 就進(jìn)入凋亡。若p53基因發(fā)生突變，則細(xì)胞對DNA損傷因素引起的細(xì)胞凋亡耐受性增加，因此突變型p53基因可影響放療、化療的療效。細(xì)胞凋亡與CDK2基因編碼p34CDK2激酶（即M期促進(jìn)因子）的活化有關(guān)，p34CDK2具有G1S和G2M雙重作用，p34CDK2激酶過早激活，可引起DNA裂解和細(xì)胞核破壞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 一般認(rèn)為癌變的重要原因是細(xì)胞周期的失控。當(dāng)Rb基因缺失、突變或磷酸化失活后，則促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，當(dāng)p53、p16基因突變或缺失時，則可間接或直接造成具有促增殖活性的CDK的過度表達(dá)，產(chǎn)生細(xì)胞增殖失控導(dǎo)致癌變。

8、二、抑癌基因與肺癌的發(fā)生和發(fā)展 近年來隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，在分子水平認(rèn)識到肺癌的形成是一個多步驟的過程，有多種基因功能失常，包括原癌基因的激活與抑癌基因的滅活等，才導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞增殖到腫瘤形成。與肺癌有關(guān)的原癌基因包括 myc、 ras 、erbB-1、 c-erbB-2、 BCL-2 、 c-fos 、c-jun、c-raf-1、c-src、 LCK基因等，約30%的NSCLC細(xì)胞系中有ras基因突變，幾乎所有的NSCLC（95%的鱗癌，75%的腺癌）中可見到c-erbB-1蛋白的過度表達(dá)，c-erbB-2 在25%的NSCLC細(xì)胞系中有過度表達(dá)，BCL-2基因在凋亡中起負(fù)調(diào)控作用，

9、在NSCLC中可有表達(dá)。與肺癌有關(guān)的抑癌基因有p53、Rb、 p16 、APH、 MCC、APC、nm23 、KAI1 等。Bai等1通過對臨床肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌的發(fā)展中，可同時有抑癌基因p53突變和癌基因 myc過度表達(dá)，而p53基因不是預(yù)后標(biāo)記，決定預(yù)后的因素是m 本文抑癌基因在肺癌治療中的新進(jìn)展(2)- yc過度表達(dá)。 Rb基因的缺失最初是在家族性成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤研究中發(fā)現(xiàn)的，后來在許多腫瘤細(xì)胞中都可觀察到Rb基因的缺失或失活，如小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤等，在肺癌組織和細(xì)胞系中Rb基因異常多表現(xiàn)為雜合子丟失、基因突變等。Michael等2研究發(fā)現(xiàn)88%的SCLC

10、和12%的NSCLC細(xì)胞系中存在Rb基因產(chǎn)物表達(dá)的缺失。 p53基因突變在人類許多常見腫瘤中均可檢測到，包括肝癌、胃癌、大腸癌、食道癌、子宮癌，肺癌等，p53基因突變是不同類型肺癌中最常見的基因改變，且出現(xiàn)的頻率比其它腫瘤要高得多。Takahashi等3發(fā)現(xiàn)SCLC中p53基因突變率最高，可達(dá)80%，NSCLC中p53基因突變率也可達(dá)60%。 p16基因的正常功能丟失的主要方式是p16基因的純合性缺失，在人類眾多惡性腫瘤中相當(dāng)普遍存在p16基因的純合性缺失，包括惡性間皮瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、星形細(xì)胞瘤、白血病、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、食管癌、胰腺癌等。Michael等2發(fā)現(xiàn)23% N

11、SCLC 細(xì)胞株可檢測到p16基因的純合性缺失，而只有1% 的SCLC細(xì)胞株存在p16基因缺失。 Washimi等4對原發(fā)性肺癌的檢測發(fā)現(xiàn)30%的NSCLC有p16的純合性缺失，而SCLC中未發(fā)現(xiàn)。許多研究結(jié)果2,4-6 均表明，p16基因的失活在NSCLC形成中起重要作用，與SCLC的形成關(guān)系不大，在SCLC的細(xì)胞株及原發(fā)腫瘤中很少檢測到p16基因的改變，而在NSCLC的細(xì)胞株及原發(fā)腫瘤中常見p16基因純合性缺失。Kratzke等7還發(fā)現(xiàn)p16純合性缺失的檢出率在NSCLC晚期比早、中期高得多，這就使p16基因具有一定的NSCLC臨床預(yù)后判斷的意義。 候選抑癌基因FHIT在NSCLC及SCL

12、C中經(jīng)常出現(xiàn)缺失，F(xiàn)HIT在肺癌中的缺失一般提示預(yù)后差。而候選抑癌基因PTEN/MMAC1/TEP1的突變在肺癌的發(fā)生中目前認(rèn)為只與SCLC有關(guān)，與NSCLC關(guān)系不大。 三、抑癌基因與肺癌基因治療研究 肺癌的基因治療是指經(jīng)某種途徑引入外源基因到肺癌細(xì)胞以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，從而達(dá)到治療目的。肺癌的基因治療包括抑癌基因治療、反義基因治療、藥物敏感基因治療、耐藥基因治療、免疫基因治療等。 肺癌的發(fā)生源于多基因損傷，抑癌基因的缺失或突變是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的原因之一。許多研究者都在探索肺      癌的抑癌基因治療，即將外源正常的抑癌基因如Rb基因、p53基因、p

13、16基因等導(dǎo)入肺癌細(xì)胞，以恢復(fù)抑癌基因抑制細(xì)胞增殖的功能，從而抑制肺癌細(xì)胞的惡性增長，達(dá)到肺癌的治療作用。目前研究最多的是抑癌基因p53。Takahashi等3發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)單個抑癌基因的功能，可明顯有效抑制多基因改變引起的肺癌的發(fā)生和生長，該研究中利用野生型p53基因轉(zhuǎn)染同時有p53突變或純合子缺失、癌基因 ras 突變、c-myc 過度表達(dá)的不同肺癌細(xì)胞系，結(jié)果均有生長抑制作用，而對于本身具有野生型p53基因的肺癌細(xì)胞，導(dǎo)入外源野生型p53基因后，產(chǎn)生的生長抑制作用則不明顯。Fujiwara等8以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體將野生型p53基因轉(zhuǎn)染人NSCLC細(xì)胞H226Br，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在體外生長明顯受到

14、抑制。在裸鼠體內(nèi)移植人肺癌細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)p53基因?qū)Ψ伟┯忻黠@抑制作用。Fujiwara等8在裸鼠氣管內(nèi)接種p53突變的人肺癌細(xì)胞系H226Br的細(xì)胞懸液，3天后用攜帶野生型p53基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行治療，采用氣管滴入法，每日1次，連續(xù)3天，30天后觀察到治療組只有0%38%的裸鼠肺內(nèi)形成了腫瘤，而對照組中62%82% 的裸鼠發(fā)生了腫瘤，且治療組中裸鼠發(fā)生的腫瘤的體積亦明顯小于對照組。高振強(qiáng)等9在裸鼠成瘤試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入野生型p53基因的人肺腺癌細(xì)胞系，成瘤晚，生長速度明顯減慢，其速度明顯低于對照細(xì)胞系和導(dǎo)入突變型p53基因的細(xì)胞系，結(jié)果證明p53基因有抑癌功能。Zou等10在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，氣管內(nèi)腫

15、塊局部注入脂質(zhì)體和野生型p53基因復(fù)合物，可顯著抑制早期癌腫生長。在外源性野生型p53基因?qū)θ朔伟┘?xì)胞生長的抑制作用的進(jìn)一步研究中，汪蕙等11采用基因槍介導(dǎo)外源野生型p53基因，建立人肺巨細(xì)胞癌系801-D的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系801-D- p53，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染細(xì)胞系801-D-p53體外長期傳代有外源p53基因存在，轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長明顯受到抑制，裸鼠異種移植致瘤性降低，腫瘤生長明顯緩慢。這是國內(nèi)首次成功地運(yùn)用基因槍轉(zhuǎn)移外源p53基因到 抑癌基因在肺癌治療中的新進(jìn)展(3) 人肺癌細(xì)胞。 大量的細(xì)胞、動物體內(nèi)的研究表明，單獨(dú)運(yùn)用病毒或非病毒為載體的野生型p53基因已經(jīng)具有明顯的抑制肺癌的效果。 盡管p16基

16、因研究起步比p53基因晚，還有許多問題待解決，但由于p16基因的純合性缺失在許多惡性腫瘤中存在，且p16基因小，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量僅為p53的1/4，便于重組和導(dǎo)入，因此理論上認(rèn)為p16基因用于腫瘤的基因治療更為可行。Jin 等12將野生型p16基因通過腺病毒載體導(dǎo)入p16基因缺失的肺癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞被阻滯在G1期，無法進(jìn)入S期，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞體內(nèi)、體外生長受到抑制。研究結(jié)果為p16抑癌基因?yàn)榉伟┗蛑委熖峁┝擞辛σ罁?jù)。 由于野生型p53基因在化療或放療引起的DNA損傷而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中是必需成分，因此化療或放療與p53基因聯(lián)合可具有更強(qiáng)的抗腫瘤性。Fujiwara等13 研究發(fā)現(xiàn)腺病毒為

17、載體的野生型p53基因可使人類NSCLC細(xì)胞系H358對化療藥物順鉑（CDDP）的敏感性在體外、裸鼠體內(nèi)有所增強(qiáng)，而且p53基因與化療藥物順鉑聯(lián)合應(yīng)用，可出現(xiàn)肺癌腫塊局部大片凋亡。Roth等14 1996年提出利用腺病毒載體構(gòu)建野生型p53表達(dá)質(zhì)粒，聯(lián)合化療藥物順鉑治療NSCLC的臨床方案，在臨床前的細(xì)胞及動物研究中發(fā)現(xiàn)p53基因可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，并引起腫塊局部的大片凋亡，單獨(dú)使用p53基因或順鉑治療NSCLC，未觀察到明顯的凋亡發(fā)生。聯(lián)合p53基因及順鉑治療NSCLC比單用其中之一，具有更顯著的腫瘤抑制作用。作者所在的研究中心開展了抑癌基因多方面的研究，采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)p

18、16、p53和p21基因單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染到NSCLC和SCLC細(xì)胞系，結(jié)果表明p16、p53、p21可抑制NSCLC細(xì)胞增殖，p16與p21基因或p16和p53基因聯(lián)合應(yīng)用能顯著增強(qiáng)對NSCLC及SCLC細(xì)胞增殖的抑制，以p16與p53作用更明顯。而且研究也證實(shí)p53基因可增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞化療敏感性。研究成果表明p53與p16基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染或p53基因聯(lián)合化療，可能成為肺癌基因替代治療的更佳選擇。 目前肺癌的抑癌基因治療的臨床試驗(yàn)已取得初步進(jìn)展。最近Roth等報道用p53基因聯(lián)合反義K-ras治療1例肺癌患者取得顯著療效。此臨床試驗(yàn)源于1993 年Anderson癌癥研究中心的Roth15向美國重

19、組DNA委員會( RAC)和美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）提出的利用抑癌基因p53和反義K-ras對NSCLC進(jìn)行腫瘤治療的臨床方案，此方案為利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNSX構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入p53基因突變的NSCLC細(xì)胞，臨床上選用內(nèi)窺鏡或激光將大塊肺癌腫塊切除，在剩余微小腫瘤灶內(nèi)注入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。臨床前的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將野生型p53基因?qū)雙53基因突變的肺癌細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的表型，可觀察到裸鼠體內(nèi)的肺癌腫塊的范圍明顯縮小，同時通過動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了該方案的安全性，Roth 等給小鼠注射350倍于擬用于人體的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)毒性。Roth等16最近對21例晚期NSCLC患者進(jìn)

20、行了p53基因替代療法的臨床試驗(yàn)，利用腺病毒載體構(gòu)建p53表達(dá)質(zhì)粒，采用腫塊內(nèi)直接注入方法，每月為病人進(jìn)行1次p53基因替代療法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6名患者臨床表現(xiàn)有效，且腫瘤活檢有p53基因的明顯表達(dá)，并觀察到凋亡。Martin等17對15例晚期NSCLC患者進(jìn)行野生型p53基因治療的臨床試驗(yàn)，結(jié)果提示野生型p53基因?qū)τ谕砥贜SCLC患者是安全，易 ( 抑癌基因在肺癌治療中的新進(jìn)展(4) ) 行，有效的。 四、問題與展望 肺癌的抑癌基因治療還處于不斷的探索中，目前已由基礎(chǔ)研究發(fā)展到臨床試驗(yàn)，然而要應(yīng)用于臨床，發(fā)展為一種肺癌的常規(guī)療法，還有一定距離。首先要解決肺癌的早期診斷問題，是否可將在肺癌早期就有

21、的抑癌基因的改變?nèi)鏿53突變作為篩查指標(biāo)，早期發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肺癌，進(jìn)一步早期治療，通過抑癌基因?qū)?，明顯有效抑制腫瘤生長，甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤的表型。再則要看到肺癌聯(lián)合治療的可行性，因?yàn)榉伟┑陌l(fā)生是多基因、多步驟的，因此可通過不同的撐淦鲾所產(chǎn)生的合力，多方面共同對抗腫瘤，在肺癌的聯(lián)合治療方面有許多問題需要進(jìn)一步深入研究，如除p53與p16基因以外其它抑癌基因共轉(zhuǎn)染的抗腫瘤性，抑癌基因與各種DNA破壞藥物的組合，以及抑癌基因與其它基因治療方法的聯(lián)合等。另外還有很多技術(shù)問題需解決，選擇高效和導(dǎo)向的理想載體系統(tǒng)，使抑癌基因在受體細(xì)胞中獲得安全高效穩(wěn)定表達(dá)，在肺癌多基因疾病中找尋有效的目的基因，以及建立動物模型，

22、治療的安全性，等等。但可以預(yù)言，不遠(yuǎn)將來，抑癌基因?qū)⒃诜伟┑幕蛑委熤邪l(fā)揮重要作用，與目前常規(guī)的放療、化療以及其它基因治療方法一起聯(lián)合治療肺癌，產(chǎn)生強(qiáng)有力的抗腫瘤效果。 參考文獻(xiàn) 1Bai L, Sun Y, Li S. Relation of p53 alteration and myc family gene overexpression with the clinical characteristics of lung cancer. Chin Med J , 1997 ,110 : 250-254. 2 Michael JK, Nakagawa K, Steinberg SM, et

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