細(xì)胞污染及處理方法

1、細(xì)胞污染及處理方法總結(jié)潔凈區(qū)，并不是沒(méi)有細(xì)菌，而是細(xì)菌的數(shù)量格外少，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)100級(jí)的潔凈標(biāo)準(zhǔn)是浮游菌數(shù)不得超過(guò)5個(gè)每立方米，沉降菌數(shù)不得超過(guò)1個(gè)每培育皿.而國(guó)外的標(biāo)準(zhǔn)比我國(guó)的還要高一點(diǎn)，要求的數(shù)量更少。所以在我們的潔凈操作臺(tái)里，并不是真正一個(gè)細(xì)菌都沒(méi)有的，所以在操作的時(shí)候還是要盡量利索快速地完成操作。盡量削減進(jìn)入培育體系細(xì)菌的數(shù)量。所以處理細(xì)菌污染的重要原則就是：無(wú)限地稀釋細(xì)菌的濃度，無(wú)限地削減細(xì)菌的數(shù)量！1、 細(xì)菌污染培育基：顏色發(fā)紅，液體清亮或渾濁；顯微鏡下：有黑點(diǎn)或桿狀物在處處游走，細(xì)胞部分脫落，消滅細(xì)胞碎片；成像：圖一：桿菌污染圖二：白色鏈球菌以下是摘自丁香園的處理方法：1） .將污

2、染的培育液倒掉，轉(zhuǎn)燒瓶口，加入10mlPBS，適當(dāng)晃動(dòng)清洗培育瓶，然后倒掉。轉(zhuǎn)燒瓶口。2） .連續(xù)加入10mlPBS，同樣方法晃動(dòng)，清洗培育瓶，然后倒掉。3） .連續(xù)加入5mlPBS，同樣方法洗瓶，主要是培育面，然后倒掉。4） .重復(fù)步驟3再洗。5） .重復(fù)步驟3再洗。6） .加入3-5ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。7） .加入3ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。8） .再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。9） .加入10ml培育液，加入2ml雙抗，放置培育箱培育，5小時(shí)之后，倒掉培育基，加入PBS洗瓶?jī)纱?，然后加入胰酶消化，吹打后置于離心機(jī)800-1000r/min離心，然

3、后洗一次。置于新的培育瓶里培育，培育體系加入2ml雙抗。10） .24h之后，視狀況換液，若仍舊污染嚴(yán)峻，培育基渾濁，重復(fù)以上步驟，若看不到污染物，則連續(xù)步驟1)、3）、4）、6）、8），然后加入培育液培育，培育體系加入2ml雙抗.11） .24h之后，若仍污染嚴(yán)峻，可再重復(fù)一次，若還污染只能棄之（不過(guò)一般沒(méi)有消滅這種狀況），若鏡下不見(jiàn)污染物，則換液PBS洗瓶，正常培育。（常見(jiàn)為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）若細(xì)胞狀態(tài)極差，盡早處理掉細(xì)胞，并找出污染源，對(duì)培育箱，生物平安柜，細(xì)胞房進(jìn)行消毒處理。2、 真菌污染培育基：有的培育液清亮，不變色；顯微鏡下：有絲狀物，有些真菌開(kāi)頭很像死細(xì)胞碎片，只是它很多

4、很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，漸漸的會(huì)長(zhǎng)出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長(zhǎng)的比較慢，不象細(xì)菌那么簡(jiǎn)潔被發(fā)覺(jué)，但是一旦發(fā)覺(jué)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。成像：圖三：看上去像白色念珠菌污染處理方法：若為霉菌或者真菌污染，加入兩性霉素B清洗和培育，終濃度一般為2.5g/ml（在30g/ml時(shí)會(huì)有細(xì)胞毒性）。另外也可以選擇在培育基里加3ug/ml的制霉菌素或放線(xiàn)菌素D。其它操作同細(xì)菌。3、 霉菌污染培育基：培育液是清亮的；顯微鏡下：絮狀雜質(zhì)，鏡下可見(jiàn)呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂移物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長(zhǎng)，但時(shí)間長(zhǎng)之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差；成像：處理方法：預(yù)防霉菌污染，可在培育基里加

5、3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線(xiàn)菌素D或雙抗；（原來(lái)我們這里也有霉菌感染的，不過(guò)后面在培育基里加上了0.5的大?？担ㄔ瓉?lái)的雙抗各改為0.25的青霉素和鏈霉素）摘自丁香園），效果還可以！你可以試試！但細(xì)胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線(xiàn)菌素D或雙抗都于事無(wú)補(bǔ)，建議舍棄該污染細(xì)胞。，將環(huán)境徹底消毒，假如全部細(xì)胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培育基和器材，假如只是個(gè)別污染，可能是操作問(wèn)題，就要留意操作 。霉菌污染多來(lái)自空氣,所以做試驗(yàn)時(shí)說(shuō)話(huà)談天,或瓶口放開(kāi)時(shí)間太長(zhǎng),還有培育箱開(kāi)關(guān)頻繁是主要緣由,還是多找自身緣由. 4、 支原體污染支原體污染后，不會(huì)馬上使細(xì)胞死亡，可以與細(xì)胞長(zhǎng)期共存，培育基一

6、般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無(wú)明顯變化，外觀上給人以正常感覺(jué)，實(shí)則細(xì)胞收到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形， 影響 DNA 合成，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等。培育基：可能無(wú)明顯表現(xiàn)；顯微鏡下：漸漸會(huì)使細(xì)胞狀態(tài)變差,生長(zhǎng)變慢，在顯微鏡下觀看可能會(huì)有小黑點(diǎn)，但培育基一般不發(fā)生 渾濁。細(xì)胞傳代以后就消滅細(xì)胞間黑點(diǎn)，細(xì)胞空泡化，很多類(lèi)似凋亡、壞死的細(xì)胞，最終細(xì)胞漂移，完全死亡。細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，或者消滅無(wú)明顯誘因脫落，凋亡，細(xì)胞碎片增多，有的甚至只表現(xiàn)為細(xì)胞狀態(tài)日漸不佳。成像：處理方法：接受支原體清除劑，有同學(xué)說(shuō)用泰樂(lè)處理支原體污染效果比較好。用泰樂(lè)菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培育，無(wú)任何不良反應(yīng)。Sigma公司的使用時(shí)

7、用50ug/ml Tylosin培育液培育6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。假如作為常用的抗生素的話(huà), 建議用8ug/ml的濃度。一般處理起來(lái)比較簡(jiǎn)單，因此多放棄細(xì)胞重新培育。5、 黑膠蟲(chóng)污染培育基：可能無(wú)明顯表現(xiàn)，或液體顏色異樣顯微鏡下：大量黑點(diǎn)原地震驚，與細(xì)菌污染相鑒別，細(xì)胞狀態(tài)不佳。有的因細(xì)胞密度較高，或細(xì)胞增殖較快，細(xì)胞代謝產(chǎn)物增多，要留意鑒別。成像：處理方法：黑膠蟲(chóng)在科研領(lǐng)域還是很未知的啊。所以沒(méi)有什么好的應(yīng)對(duì)方法。預(yù)防為主！還是要強(qiáng)調(diào)無(wú)菌操作??！尤其留意血清的質(zhì)量！這個(gè)是主要來(lái)源。一般建議用北美血清，這個(gè)黑膠蟲(chóng)污染會(huì)概率小。6、 原蟲(chóng)污染培育基：培育液可稍微渾濁顯微鏡下：細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量格外多，稍微活動(dòng)，細(xì)胞雖然可以生長(zhǎng)但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭(zhēng)奪養(yǎng)分。這種共生是格外普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，只有當(dāng)他們到達(dá)肯定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終形成惡性循環(huán)。成像：處理方法：在操作的過(guò)程中，肯定要當(dāng)心操作動(dòng)作，輕柔緩慢，切忌大動(dòng)作魯莽。防止細(xì)胞脫落。這個(gè)挽救細(xì)胞還是主要針對(duì)無(wú)路可退的時(shí)候。污染還是重在預(yù)防！細(xì)胞房培育箱每?jī)芍芨鼡Q一次水（高壓過(guò)的雙蒸水），條件允許的每?jī)芍芸梢杂镁凭料匆槐榕嘤?；地面每?jī)傻饺煊眯聺崰枩缤舷匆槐椋烂娴韧?/p>