假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體高效介導(dǎo)兔平滑肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染

1、假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體高效介導(dǎo)兔平滑肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染         11-01-07 09:59:00     編輯：studa20                   作者：裴斐，何蕊，李俊彥，余紅【摘要】  目的 構(gòu)建假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MuLV/VSVG，并用于轉(zhuǎn)染兔平滑肌細(xì)胞，為兔平滑肌

2、細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染尋找一種高效的載體。方法 構(gòu)建含有報(bào)道基因lacZ的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MuLV/VSVG，測(cè)定滴度，并轉(zhuǎn)染兔平滑肌細(xì)胞，觀察其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。并與MuLV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率進(jìn)行比較。結(jié)果 構(gòu)建的MuLV/VSVG載體，病毒滴度為67.8×106CFU，轉(zhuǎn)染兔平滑肌細(xì)胞的效率是(92±12)%。而MuLV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為(24±5)%。結(jié)論 成功構(gòu)建了假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MuLV/VSVG載體，該載體作為一種高效的載體可用于兔平滑肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染。 【關(guān)鍵詞】  假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；平滑肌細(xì)胞；轉(zhuǎn)染ABSTRACT: Objective  To const

3、ruct pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG and transfer it into rabbit smooth muscle cells (SMC) in order to provide a highefficiency vector for SMC gene transfer. Methods  We constructed pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG containing the previously reported gene lacZ, determined the tite

4、r, and determined the efficiency of gene transfer into SMC mediated by pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG. Finally the transfer efficiency was compared with that by MuLV. Results  MuLV/VSVG vector was constructed. The titer of the vector was 6-7.8×106CFU, the transfer efficiency was (

5、92±12)% by using MuLV/VSVG vector and (24±5)% by MuLV vector. Conclusion  Pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG which was constructed successfully is a kind of highefficiency gene transfer vector in smooth muscle cells.KEY WORDS: pseudotyped retroviral vector; smooth muscle cell; ge

6、ne transfer基因治療是指將具有防治潛能的外源基因，通過相應(yīng)的載體轉(zhuǎn)移到患者的有關(guān)組織器官和細(xì)胞內(nèi)，獲得適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)達(dá)到防治和減輕疾病的目的。其中目的基因載體的選擇是基因治療的關(guān)鍵之一。逆轉(zhuǎn)錄病毒是較常用的一種病毒載體。鼠白血病病毒MuLV衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被廣泛應(yīng)用于將基因轉(zhuǎn)染到哺乳細(xì)胞中并長(zhǎng)期表達(dá)1。但該載體穩(wěn)定性差，產(chǎn)生的病毒滴度低，轉(zhuǎn)染到人類細(xì)胞效率低，并且只能轉(zhuǎn)染分裂期細(xì)胞。VSVG，皰疹性口炎蛋白VSV的包膜蛋白，是一種單鏈蛋白，可以完全替代MuLV的env蛋白，產(chǎn)生基于MuLV的高轉(zhuǎn)染率的病毒載體MuLV/VSVG，已經(jīng)被用來構(gòu)建假型MuLV/VSVG以提高M(jìn)uLV載體的

7、穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)染效率2。本研究用兔平滑肌細(xì)胞作為靶細(xì)胞，觀察MuLV/VSVG的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并與MuLV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率進(jìn)行比較，探討MuLV/VSVG用于平滑肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的可行性。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器 一月齡新西蘭兔；小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3(美國(guó)邁阿密大學(xué)外科實(shí)驗(yàn)室)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；小牛血清(杭州四季青生物技術(shù)材料研究所)；胰蛋白酶(Sigma公司)；多聚季胺(polybrene)儲(chǔ)用液(8g/L)(Sigma公司)；G418儲(chǔ)用液(50g/L)(GIBCO/BRL)；CO2培養(yǎng)箱、無菌超凈臺(tái)、離心機(jī)、倒置顯微鏡。1.

8、2  細(xì)胞株和質(zhì)粒 人293T細(xì)胞、293/GPG包裝細(xì)胞系由余紅博士饋贈(zèng)；pCnBgSN3是lacZ基因的表達(dá)質(zhì)粒；質(zhì)粒pHIT604是鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒(murineleukemia retrovirus, MuLV)Gag和Pol蛋白的表達(dá)質(zhì)粒；質(zhì)粒pCVG2是皰疹性口炎病毒G糖蛋白(vesicular stomatitis virus G glycoprotein, VSVG)的表達(dá)質(zhì)粒。所有質(zhì)粒由美國(guó)邁阿密大學(xué)外科實(shí)驗(yàn)室余紅博士提供。所有質(zhì)粒DNA均用大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN BIOTECH)擴(kuò)增，并用試劑盒(Valencia, CA)從大腸桿菌中

9、提取。1.3  方法一月齡大耳白兔用水合氯醛腹腔注射麻醉后，在無菌條件下，迅速將頸內(nèi)靜脈取出，盛入有PBS液的平皿中。洗凈血塊，剝除外膜，將血管翻轉(zhuǎn)內(nèi)膜面朝外，用刀片自上而下刮12遍，去除VEC。然后用顯微鑷撕下血管中膜的平滑肌層，將其剪碎(0.51mm3)，接種于培養(yǎng)瓶中，在CO2培養(yǎng)箱中放置2.53.0h，使組織塊較牢固地黏附于瓶壁，加入含200mL/L新生牛血清的DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM, Gibco)培養(yǎng)液，34d更換培養(yǎng)液一次。細(xì)胞生長(zhǎng)形成致密單層時(shí)，用1.25g/L胰蛋白酶消化，按12比例傳代培養(yǎng)，56d可繼續(xù)

10、傳代一次5。實(shí)驗(yàn)采用第24代細(xì)胞進(jìn)行研究。含100mL/L滅活胎牛血清(杭州四季青生物制品研究所)，2mmol/L谷氨酰胺，100mg/L青霉素及100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置37，50mL/L CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天半量換液，細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，存活細(xì)胞百分率95%(臺(tái)盼藍(lán)拒染法)，備用。MuLV及MuLV/VSVG載體均參考三個(gè)質(zhì)粒短暫轉(zhuǎn)染體系3方法生產(chǎn)，二者均含有2半乳糖苷酶報(bào)道基因。293T/17細(xì)胞(美國(guó)邁阿密外科基因?qū)嶒?yàn)室凍存，1×106個(gè)細(xì)胞/10cm直徑培養(yǎng)皿)。采用改良磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染法。MuLV加入質(zhì)粒DNA pCnBgSN，pHIT60

11、和pCAE各10g；MuLV/VSVG則加入質(zhì)粒pCnBgSN，pHIT60和pCVG各10g，轉(zhuǎn)染16h后將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含有10mmol/L sodium butyrate(Sigma)的培養(yǎng)基，12h后，以6mL新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，以生產(chǎn)病毒，培養(yǎng)12h后，收獲含有病毒顆粒的上清，0.4m的濾器過濾后分裝，-70保存，備病毒滴度測(cè)定及轉(zhuǎn)導(dǎo)。采用G418克隆篩選法6：第1天，將NIH3T3細(xì)胞放入30mm的六孔板中(5×104細(xì)胞/孔)；第2天，將病毒上清液與多聚季胺混存(終濃度為8mg/L)，滴度測(cè)定時(shí)以含有多聚季胺的DMEM培養(yǎng)液以110梯度稀釋上清，循六孔板以16孔序號(hào)形成10-110-6個(gè)稀釋濃度；第3天，以3mL含0.8g