反向微膠團萃取與雙水相萃取

1、反向微膠團萃取與雙水相萃取一、反相微膠團萃取的概念 由于在水溶液中加入表面活性劑而形成的膠體結(jié)構(gòu)中，表面活性劑的活性基團（即親水性部分）朝外，即靠向水溶液，而非極性基團（即疏水性部分）則靠內(nèi)而互相聚集成一種結(jié)構(gòu)。 上述情況發(fā)生在以極性液體（大多數(shù)情況下是水）作為溶劑的情況下。 如果溶劑為非極性液體，當(dāng)加入活性劑至一定濃度時，由于表面活性劑的極性和非極性基團的定向排列，也會形成微膠團結(jié)構(gòu)。但是這種結(jié)構(gòu)與上述結(jié)構(gòu)相反，表面活性劑的非極性基團部分朝外，即朝向非極性溶劑部分，而極性基團部分則朝內(nèi)，因而形成一種與水相微膠團結(jié)構(gòu)反相的聚集體，這種聚集體就稱為反相微膠團。 在反相微膠團中，表面活性劑的極性基

2、團部分圍成一個極性核心，稱為水池。這個水池包括表面活性劑的極性基團內(nèi)表面和其中的水分，以及溶解于水中的離子等。具有親水性的大分子就可以溶解于水池中的水分而被以微膠團的形式萃取出來。 將待分離組分以微膠團形式進行萃取的過程，稱為微膠團萃取或膠團萃取，如待分離組分是以反相微膠團的形式被萃取，就稱為反相微膠團萃取。二、反相微膠團萃取的原理 在反相微膠團萃取過程中，蛋白質(zhì)或酶等生物大分子主要以水殼的形式存在于反相微膠團中的極性核心部分，能避免與有機溶劑直接接觸，因而可以盡量的保持整個萃取過程中生物大分子活性不喪失，這樣，既能溶出酶和蛋白質(zhì)等生物大分子，又能與水相分離，并盡可能的保存了這些生物大分子的生

3、物活性。 關(guān)于蛋白質(zhì)被反相微膠團的萃取機理有三種見解：（1）在反相微膠團中，由表面活性劑的極性部分圍成一個中心，中心為水等極性溶劑占有，生物大分子就溶解其中，并且在生物大分子周圍包膜著一層水殼，對生物大分子起保護作用。即所謂的水殼模型。此種說法最有說服力。（2）認(rèn)為生物大分子雖然溶解于表面活性劑極性部分圍成的中心，但在中心部分生物大分子是以被吸附的狀態(tài)附著于膠團的極性壁上。（3）認(rèn)為生物大分子的非極性部分與多個微膠團的非極性部分連接，由此形成生物大分子溶解于多個微膠團之間的一種狀態(tài)。 反相微膠團的形成、大小及形狀，與表面活性劑的種類、濃度以及操作時的溫度、壓力等有關(guān)。反相微膠團一般比水相微膠團

4、要小，其分子聚集數(shù)一般都小于50。而水相微膠團的分子聚集數(shù)在50100之間。反相微膠團中的水分含量通常用非極性溶劑中的水濃度和表面活性劑之比0來表示： 0H2O/表面活性劑0值越大，反相微膠團內(nèi)的水分含量就越多，形成的反相微膠團的半徑就越大。能溶解水溶性成分的量就越多。因此， 0值大小可以反應(yīng)出反相微膠團的大小和溶解能力。1、表面活性劑和溶劑的種類表面活性劑在溶劑中的濃度必須達到一定值，否則就不能形成微膠團，這個形成微膠團所必須的最低濃度叫做表面活性劑形成微膠團的臨界濃度（CMC）。 不同表面活性劑的CMC值在0.11mmol/L之間，隨溫度、壓力、溶劑的變化而變化。最常用:表面活性劑-丁二酸

5、二異辛酯磺酸鈉 （Aerosol OT，簡稱AOT）， 溶劑-異辛烷（2，2，4三甲基戊烷）。AOT能溶解在有機溶劑中，也能溶解在水中，形成反相微膠團。AOT在形成反相微膠團時的0值較大，可達60。2、水相酸堿度 微膠團內(nèi)水分的酸堿度主要影響到生物大分子的荷電性，進而影響到生物大分子和反相微膠團的結(jié)合。 AOT屬于陰離子型表面活性劑，其親水部分帶負(fù)電荷，形成的反相微膠團內(nèi)表面帶負(fù)電。當(dāng)反相微膠團內(nèi)水相的pH值小于生物大分子的等電點pI時，可使生物大分子帶正電，這樣生物大分子可與反相微膠團中帶負(fù)電性的內(nèi)表面相吸，形成比較穩(wěn)定的含生物大分子的反相微膠團，可以較容易的進行萃取。3、水相中的離子強度

6、反相微膠團中水相離子強度對反相微膠團萃取的影響可以用鹽溶和鹽析現(xiàn)象來解釋。在低離子強度下，酶和蛋白質(zhì)等生物大分子表面上的荷電性和親水性得到了改善，溶解度上升，與反相微膠團的內(nèi)表面的結(jié)合能力增強。當(dāng)水相中的離子強度升高到一定程度時，由于抵消了生物大分子表面上的電荷，并且由于離子的水化作用而使蛋白質(zhì)分子表面上的水膜消失，減少了與反相微膠團的內(nèi)表面的結(jié)合作用，從而降低了溶解度，使分離效率降低。4、 0值的大小0值的大小也直接影響到反相微膠團的萃取效率。0值太小，說明反相微膠團內(nèi)的水分含量不高，對生物大分子的溶解度下降，甚至當(dāng)0值過小時，形成的反相微膠團太小，生物大分子根本無法進入反相微膠團內(nèi)，這樣就

7、必然影響到萃取效率。反相微膠團的分離過程分兩步：第一步：含生物大分子的反相微膠團的形成第二步：反相微膠團的破乳及生物大分子的釋放。形成含生物大分子的反相微膠團的方法有多種，最常用到的有3種：1、相轉(zhuǎn)移法 通過含生物大分子的水相與溶解有表面活性劑的有機相接觸，緩慢的攪拌，在形成反相微膠團的同時，其中的生物大分子就轉(zhuǎn)移到反相微膠團中，直到處于萃取的平衡狀態(tài)為止。2、注入法 通過將含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性劑的有機相中，從而實現(xiàn)萃取過程。3、溶解法 對固體粉末中含有的生物大分子，或不溶于水的生物大分子，可采用溶解法進行。其過程是先制備好含水（0330左右）的反相微膠團的有機溶液，然后把

8、含生物大分子的固體粉末加入此中反相微膠團的有機溶液中，同時攪拌，生物大分子慢慢地即可進入到反相微膠團內(nèi)的水中心而實現(xiàn)萃取過程。 生物大分子的釋放： 可參考液膜分離的方法，將混合液送入到澄清器中，使反相微膠團與外相有機溶劑分離。然后對溶解有生物大分子的反相微膠團進行破乳以釋放其中的生物大分子，破乳的原理和方法有化學(xué)破乳和物理破乳等，可以參考液膜分離技術(shù)。 以溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的萃取為例說明影響萃取效果的因素1、水相pH值對蛋白質(zhì)萃取的影響 水相的pH值對蛋白質(zhì)的萃取影響較大。溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的萃取率在pH9時，接近100，隨著pH值的增大，萃取率下降，并在其 等電點時（pI11

9、.1）附近急劇下降，直至萃取率接近零。2、鹽濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響該影響主要來自兩方面：（1）離子強度增大時，反相微膠團內(nèi)表面的雙電層變薄，使蛋白質(zhì)表面與反相微膠團表面之間的靜電引力下降；（2）反相微膠團的內(nèi)表面的雙電層變薄后，也減小了表面活性劑極性頭之間的斥力，使反相微膠團變小。反相微膠團的大小正比于含水量0。3、蛋白質(zhì)相對分子量對萃取的影響 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分相對子量大于30000時，最大萃取率小于60，效果明顯下降，因此如何使反相微膠團變得足夠大，使其能包住蛋白質(zhì)，是反相微膠團萃取中有待解決的一個重要課題。4、陽離子種類對萃取率的影響 陽離子種類對萃取率的影響主要體現(xiàn)在改變反相微膠團內(nèi)表面的電

10、荷密度上。通常反相微膠團中表面活性劑的極性部分不會是完全電離的，有很大一部分陽離子仍在膠團的內(nèi)表面上。極性部位的電離程度愈大，反相微膠團內(nèi)表面的電荷密度越大，產(chǎn)生的反相微膠團也愈大。一、概述 雙水相萃取技術(shù)是60年代以來研究開發(fā)的新型分離技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物工程等領(lǐng)生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物工程等領(lǐng)域，實現(xiàn)了生物產(chǎn)品的分離和純化。90年代以來，采用雙水相萃取技術(shù)提取分離生物小分子的研究已有報道。1、概念 雙水相系統(tǒng)雙水相系統(tǒng)是指某些高聚物之間或高聚物與無機鹽之間在水中以適當(dāng)?shù)臐舛热芙?，形成的互不相溶的兩水相或多水相系統(tǒng)。 通過溶質(zhì)在相間的分配系數(shù)的差異，進行組分分離或多

11、水相提取的技術(shù)即為雙水相萃取雙水相萃取。 混合物的不溶性最初是由貝杰林克（Beijerinck）通過把（明膠瓊脂）溶液與（明膠可溶性淀粉）溶液相混合時發(fā)現(xiàn)的。之后發(fā)現(xiàn)這是一種普遍現(xiàn)象，把多種不相溶的聚合物溶液混合在一起，可以得到多相體系，最多的有時達18個相。雙水相體系組成聚合物-聚合物-水聚丙烯乙二醇-聚乙二醇甲氧基聚乙二醇-聚乙烯醇聚乙二醇-葡萄糖聚乙烯吡咯烷酮-甲基纖維素鈉高分子電解質(zhì)-聚合物-水硫酸鹽葡聚糖鈉鹽-聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖鈉鹽-甲基纖維素高分子電解質(zhì)-高分子電解質(zhì)-水硫酸鹽葡聚糖鈉鹽-羧基甲基纖維素鈉鹽硫酸鹽葡聚糖鈉鹽-羧基甲基葡聚糖鈉鹽聚合物-低分子組分-水聚丙烯乙二

12、醇-磷酸鉀甲氧基聚乙二醇-磷酸鉀聚乙二醇-磷酸鉀聚丙烯乙二醇-葡萄糖 雙水相技術(shù)具有較高的選擇性和專一性，該技術(shù)簡單、方便且不存在有機溶劑殘留等問題，因此有廣闊的應(yīng)用前景。 雙水相萃取也存在著某些缺點制約著其大規(guī)模應(yīng)用和發(fā)展，例如某些高聚物的價格高，常常需要高濃度的鹽才能進行有效的分離，因此難以應(yīng)用于無法使用高鹽濃度的親和分離過程。2.原理在系線上各點處系統(tǒng)的總濃度不同，但均分成組成相同而體積不同的兩相。兩相的體積近似服從杠桿規(guī)則，即系線雙節(jié)線 在系線上各點處系統(tǒng)的總濃度不同，系線的長度是衡量兩相間相對差別的尺度，系線越長，兩相間的性質(zhì)差別越大，反之則越小。當(dāng)系線長度趨向于零時，即在圖b的雙節(jié)

13、線上c點，兩相差別消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1，因此c點稱為臨界點a雙節(jié)線系線均相區(qū)兩相區(qū)臨界點b雙節(jié)線均相區(qū)兩相區(qū)系線臨界點3 .優(yōu)點： 雙水相萃取之所以受到重視主要是由于對生化分離具有明顯的優(yōu)點： (1)易于放大，各種參數(shù)可以按比例放大40000倍以上，而產(chǎn)物收率并不降低，這是其他過程無法比擬的，這一點對于工業(yè)應(yīng)用尤為有利；(2)由于雙水相系統(tǒng)之間的傳質(zhì)過程和平衡過程快速，因此相對于某些分離過程來說，能耗較小，而且可以實現(xiàn)快速分離。聚合物可以重復(fù)使，成本低。(3)易于進行連續(xù)化操作，例如可以采用高分配系數(shù)和選擇性的多級逆流分配。 (4)由于雙水相的相間張力大大低于有機溶劑與水相之

14、間的相間張力，相分離過程溫和，使生化分子如酶不易受到破壞，而且可以直接在雙水相系統(tǒng)中進行生物轉(zhuǎn)化以消除產(chǎn)物抑制； (5)由于雙水相系統(tǒng)受影響的因素復(fù)雜，從某種意義上說可以采取多種手段來提高選擇性或提高收率；(6)整個操作過程可以在室溫下進行，操作條件溫和。 雙水相萃取在分離細(xì)胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)的過程中顯示出極大的優(yōu)越性和發(fā)展?jié)摿Γ?（1）大多數(shù)情況下目標(biāo)產(chǎn)物的回收率高于90； （2）目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)多在120范圍，一般都大于3； （3）大量雜質(zhì)蛋白能夠與所有固體物質(zhì)一起被去掉，與其他常用固液分離方法相比，雙水相萃取可省去一到兩個過程。二、影響組分在雙水相系統(tǒng)中分配的主要因子1.聚合物的相對分

15、子質(zhì)量 聚合物的相對分子質(zhì)量增加，生物大分子或顆粒在該聚合物在該相中的分配系數(shù)會下降。2.成相溶液的濃度 當(dāng)成相溶液濃度接近臨界點時，可溶性組分會均勻的分配在兩相中，當(dāng)遠(yuǎn)離臨界點時則趨向一側(cè)分配。3、無機鹽對于帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，其分配系數(shù)因陽離子的存在按下列順續(xù)降低Li+NH4+Na+Cs+K+一價陰離子則按下列順序降低： F-Cl-Br-I-所以為了增加帶負(fù)電的蛋白質(zhì)的分配系數(shù)應(yīng)使用Li+、HPO42-、SO42-和2價檸檬酸根離子等，降低分配系數(shù)則用KCI、和NaCl。4、 pH值 pH值對組分的影響較為復(fù)雜。5、溫度 溫度的變化可以改變相的組成，溫度升高時，兩相中蛋白質(zhì)的分布趨于一致，增加聚合物的濃度，可