GC、HPLC、MS檢測(cè)方法知識(shí)匯總

1、GC、HPLC、MS檢測(cè)方法知識(shí)匯總1色譜分析法：色譜法是一種分離分析方法。它利用樣品中各組分與流動(dòng)相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交換等性能上的差異)，先將它們分離，后按一定順序檢測(cè)各組分及其含量的方法。2色譜法的分離原理：當(dāng)混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí)，就會(huì)與柱中固定相發(fā)生作用(溶解、吸附等)，由于混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相發(fā)生作 用的大小、強(qiáng)弱不同，在同一推動(dòng)力作用下，各組分在固定相中的滯留時(shí) 間不同，從而使混合物中各組分按一定順序從柱中流出。這種利用各組分 在兩相中性能上的差異，使混合物中各組分分離的技術(shù)，稱為色譜法。3流動(dòng)相 一一色譜分離過程中攜帶組分向前移

2、動(dòng)的物質(zhì)。4固定相一一色譜分離過程中不移動(dòng)的具有吸附活性的固體或是涂漬在載體表面的液體。5色譜法的特點(diǎn)：(1)分離效率高，復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。(2)靈敏度高，可以檢測(cè)出g.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。(3)分析速度快，一般 在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。應(yīng)用范圍廣，氣相色譜：沸點(diǎn)低于400 C的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、 熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。(5)高選擇性：對(duì)性質(zhì)極為相似的組分有很強(qiáng)的分離能力.。不足之處：被分離組分的定性較為困難。6色譜分析法的分類：按兩相狀態(tài)分類，按操作形式分類，按分離原理分類。7按兩相狀

3、態(tài)分類：氣相色譜(GaS Chromatography, GC),液相色譜(LiquidChrOmatOgraPhy, LC),超臨界流體色譜(SUPerCritiCalFIUidChromatography, SFC)。氣相色譜：流動(dòng)相為氣體(稱為載氣)。常用的氣相色譜流動(dòng)相有 N2、H2、He等氣體，按分離柱不同可分為：填充柱色譜 和毛細(xì)管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜。 液相色譜：流動(dòng)相為液體(也稱為淋洗液)。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。 超臨界流體色譜：流動(dòng)相為超臨界流體。超臨界流體是一種介于氣體和液 體之間的狀態(tài)。超臨界流體色譜法是集氣相色譜法和液相色譜

4、法的優(yōu)勢(shì)而 發(fā)展起來的一種新型的色譜分離分析技術(shù)，不僅能夠分析氣相色譜不宜分 析的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性的試樣組分，而且具有比高效液相色譜更快的分析 速率和更高的柱效率。8按操作形式分類：柱色譜(Column Chromatography, CC):固定相裝在柱管內(nèi)；包括填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜。紙色譜 (PaPer Chromatography, PC) 固定相為濾紙；采用適當(dāng)溶劑使樣品在濾紙上展開而進(jìn)行分離。薄層色譜(Thin LayerChromatography, TLC)固定相壓成或涂成薄層；操作方法同紙色譜。9按分離原理分類 ：吸附色譜(AbSOrPtiOn chromatography

5、);分配色譜(PartitiOnChromatography);離子交換色譜 (Ion EXChange Chromatography); 凝膠色譜(Gel ChrOmatOgraPhy)。10色譜圖：組分在檢測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間(t)所作的圖，由于它記錄了各組分流出色譜柱的情況，所以又叫色譜流出曲線。流出曲線的突起部分稱為色 譜峰。11色譜保留值：色譜保留值是色譜定性分析的依據(jù)，它體現(xiàn)了各待測(cè)組分在色譜柱上的滯 留情況。在固定相中溶解性能越好，或與固定相的吸附性能越強(qiáng)的組分， 在柱中的滯留時(shí)間越長(zhǎng)，或者說將組分帶出色譜柱所需的流動(dòng)相體積越大。 所以保留值可以用保留時(shí)間和保留體積兩套參數(shù)

6、來描述。12色譜圖上的色譜流出曲線可以說明什么問題：根據(jù)色譜峰的數(shù)目，可判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)；根據(jù)色譜峰的保留值進(jìn)行定性分析；根據(jù)色譜峰的面積或峰高進(jìn)行定量分析；根據(jù)色譜峰的保留值和區(qū)域?qū)挾仍u(píng)價(jià)色譜柱的分離效能；根據(jù)兩峰間的距離，可評(píng)價(jià)固定相及流動(dòng)相選擇是否合適。13分配比：分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí) 的質(zhì)量比。14在色譜流出曲線上， 兩峰之間的距離主要由兩組分在兩相間的分配系數(shù) 還是擴(kuò)散速度決定？為什么？答：分配系數(shù)。兩峰間的距離由熱力學(xué)因素決定，兩組分在兩相中分配系 數(shù)差異越大，兩峰間的距離則相差越大，越容易被分離。而擴(kuò)散速度是動(dòng) 力學(xué)因素，反映在色譜流出

7、曲線上即為色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋ㄐ螤睿?5色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。16組分保留時(shí)間為何不同 ？色譜峰為何變寬？組分保留時(shí)間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) ）色譜峰變寬：色譜過程的動(dòng)力學(xué)因素控制；（兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散作用）塔板理論和速率理論分別從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的角度闡述了色譜分離效能及 其影響因素。17半經(jīng)驗(yàn)理論 ：將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）。18塔板理論的特點(diǎn)：塔板理論引入了塔板數(shù)和塔

8、板高度作為柱效的衡量指標(biāo)；不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì) ；柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù) K相同時(shí)，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。19塔板理論的不足：塔板理論的基本假設(shè)不符合色譜柱的實(shí)際分離過程。塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的流動(dòng)相流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不能說明色譜峰為什么會(huì)展寬，同時(shí)未能指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑和方法。20速率方程（也稱范第姆特方程式）：H = A + B/u + C U ， H :塔板高度；U :流動(dòng)相 的平均線速度（cms）。A 渦流擴(kuò)散項(xiàng)：A與流

9、動(dòng)相性質(zhì)、流動(dòng)相速率無關(guān)。要減小 A值，需要 從提高固定相的顆粒細(xì)度和均勻性以及填充均勻性來解決。對(duì)于空心毛細(xì)管柱，A=O。固定相顆粒越小 dp填充的越均勻，A J,H 柱效n 。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。B/u 分子擴(kuò)散項(xiàng) ：存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散；擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H n J）,分離變差；;分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速J，滯留時(shí)間T，擴(kuò)散;擴(kuò)散系數(shù)：Dg X（M載氣）-1/2 ; M 載氣T，B值J。C U 傳質(zhì)阻力項(xiàng) ：dp J， df J D ,可降低傳質(zhì)阻力。21 H - U 曲線與最佳流速 ：由于流速對(duì)這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對(duì)柱效的總影響使得存在

10、著一個(gè) 最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以 塔板高度H對(duì)應(yīng)流速U作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。22速率理論的要點(diǎn) ：組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及 傳質(zhì)阻力使兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展、柱 效下降的主要原因；通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載 氣流速可提高柱效；速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響；各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子

11、擴(kuò)散的影響。選擇 最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。23色譜定性方法1、與標(biāo)樣對(duì)照的方法 ：利用保留值定性：通過對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì) 相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。 不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對(duì)比。利用加入法定性：將純物質(zhì) 加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對(duì)變化。2 、利用文獻(xiàn)保留值定性：利用相對(duì)保留值r21定性。相對(duì)保留值 r21僅與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)。 在色譜手冊(cè)中都列有各種物質(zhì)在不同固定相上的保留數(shù)據(jù)，可以用來進(jìn)行 定性鑒定。24色譜定量分析 ：1、定量校正因子：試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比，即：mi =fi ' Ai ;絕對(duì)

12、校正因子：比例系數(shù) f i ,單位面積對(duì)應(yīng)的物質(zhì)量：f i ' =m1 / Ai ;相對(duì)校正因子f i :即組分的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因 子之比。2 、常用的幾種定量方法：(1 )歸一化法：特點(diǎn)及要求：歸一化法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確；進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性和操作條件的變動(dòng)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大；僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。(2 )外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：特點(diǎn)及要求：外標(biāo)法不使用校正因子，準(zhǔn)確性較高，操作條件變化對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大。對(duì)進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要 求較高，適用于大批量試樣的快速分析(3 )內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求：(a)試樣中不含有該物質(zhì)；(b)與被測(cè)組分性質(zhì)比較接近;(C)不與試樣

13、發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；(d)出峰位置應(yīng)位于被測(cè)組分 附近，且能分離開;(e)加入量適中并與待測(cè)組分接近。內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn)：內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高，操作條件和進(jìn)樣量的稍許變動(dòng)對(duì)定量結(jié)果的影響不大；每個(gè)試樣的分析，都要進(jìn)行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析；若將內(nèi)標(biāo)法中的試樣取樣量和內(nèi)標(biāo)物加入量固定，貝U:wi=AiAs * 常數(shù)。氣相色譜法1氣相色譜法(GC ):是以氣體為流動(dòng)相的色譜分析法。2氣相色譜要求樣品氣化，不適用于大部分沸點(diǎn)高和熱不穩(wěn)定的化合物，對(duì)于腐蝕性能和反應(yīng)性能較強(qiáng)的物質(zhì)更難于分析。大約有15%-20%的有機(jī)物能用氣相色譜法進(jìn)行分析。3氣相色譜儀的組成：氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、溫

14、控系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)。4氣路系統(tǒng)：包括氣源、凈化器和載氣流速控制；常用的載氣有：氫氣、氮?dú)?、氦氣?進(jìn)樣系統(tǒng)：包括進(jìn)樣裝置和氣化室。氣體進(jìn)樣器(六通閥)：試樣首先充滿定量管，切入后，載氣攜帶定量管中的試樣氣體進(jìn)入分離柱；液體進(jìn)樣器：不同規(guī)格的微量注射器，填充柱色譜常用10讓；毛細(xì)管色譜常用1 L;新型 儀器帶有全自動(dòng)液體進(jìn)樣器，清洗、潤(rùn)沖、取樣、進(jìn)樣、換樣等過程自動(dòng) 完成，一次可放置數(shù)十個(gè)試樣。6進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣：樣品在汽化室內(nèi)氣化，蒸氣大部分經(jīng)分流管道放 空，只有極小一部分被載氣導(dǎo)入色譜柱；不分流進(jìn)樣：樣品直接注入色譜的汽化室，經(jīng)過揮發(fā)后全部引入色譜柱。7分離系統(tǒng)：色譜柱：填充柱（2-6 mm

15、 直徑，1-5 m 長(zhǎng)），毛細(xì)管柱（0.1-0.5 mm直徑，幾十米長(zhǎng)）。8溫控系統(tǒng)的作用：溫度是色譜分離條件的重要選擇參數(shù);:氣化室、色譜柱恒溫箱、檢測(cè)器三部分在色譜儀操作時(shí)均需控制溫度；氣化室：保證液體試樣瞬間氣化；檢測(cè)器：保證被分離后的組分通過時(shí)不在此冷凝；色譜柱恒溫箱：準(zhǔn)確控制分離需要的溫度。9檢測(cè)系統(tǒng)：作用：將色譜分離后的各組分的量轉(zhuǎn)變成可測(cè)量的電信號(hào)；指標(biāo)：靈敏度、線性范圍、響應(yīng)速度、結(jié)構(gòu)、通用性。通用型一一對(duì)所有物質(zhì)均有響應(yīng)；專屬型一一對(duì)特定物質(zhì)有高靈敏響應(yīng)。檢測(cè)器類型：濃度型檢測(cè)器：熱導(dǎo)檢測(cè)器、電子捕獲檢測(cè)器 ；質(zhì)量型檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器、火焰光度 檢測(cè)器。10熱導(dǎo)檢測(cè)器

16、的主要特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好；對(duì)無機(jī)物和有機(jī)物都有 響應(yīng)，不破壞樣品；靈敏度不高。11氫火焰離子化檢測(cè)器的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1）典型的質(zhì)量型檢測(cè)器；（2）通用型檢測(cè)器（測(cè)含C有機(jī)物）;（3）氫焰檢測(cè)器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、靈敏度 高、響應(yīng)迅速、死體積小、線性范圍寬等特點(diǎn)；（4）比熱導(dǎo)檢測(cè)器的靈敏度高出近3個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)下限可達(dá) 10-12g g-1。缺點(diǎn)：（1）對(duì)載氣要求高 檢測(cè)時(shí)要破壞樣品，無法回收樣品（3）不能檢測(cè)永久性氣體、水及四氯化碳等。12電子俘獲檢測(cè)器的特點(diǎn)：對(duì)鹵素、硫、磷、氮、氧有很強(qiáng)的響應(yīng)；靈敏度高，可用于痕量農(nóng)藥殘留物的分析；線性范圍較窄。13火焰光度檢測(cè)器（FPD）:是一種

17、對(duì)含硫、磷化合物具有高選擇性的檢測(cè)器。含硫、磷化合物在富氫火焰中燃燒被打成有機(jī)碎片，發(fā)出不同波長(zhǎng)的 特征光譜。14固定相：固體固定相：固體吸附劑；液體固定相：由載體和固定液組成 聚合物固定相。15固體固定相：一般為固體吸附劑，常用的有活性炭，硅膠，氧化鋁和 分子篩。優(yōu)點(diǎn)：吸附容量大、熱穩(wěn)定性好、價(jià)格便宜；缺點(diǎn)：柱效低、吸附活性中心易中毒，使用前要進(jìn)行活化。 應(yīng)用：主要用于惰性氣體、H2、02、 N2、CO、C02和CH4等一般氣體和低沸點(diǎn)物質(zhì)。16作為載體使用的物質(zhì)應(yīng)滿足的條件：表面有微孔結(jié)構(gòu)，孔徑均勻，比表面積大；化學(xué)和物理惰性，即與樣品組分不起化學(xué)反應(yīng)，無吸附作用或吸附很弱;熱穩(wěn)定性好；有

18、一定的機(jī)械強(qiáng)度和浸潤(rùn)性，不易破碎；具有一定的粒度 和規(guī)則的形狀，最好是球形。17對(duì)固定液的要求 ：在使用溫度下是液體，具有較低的揮發(fā)性；具有良好的熱穩(wěn)定性；對(duì)要分離的各組分應(yīng)具有合適的分配系數(shù)；化學(xué)穩(wěn)定性好，不與樣品組分、載氣、載體發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)。18固定液的分類：非極性固定液、中等極性固定液、強(qiáng)極性固定液、氫 鍵型固定液。19非極性固定液 ：主要是一些飽和烷烴和甲基硅油，它們與待測(cè)物質(zhì)分子之間的作用力以色散力為主。組分按沸點(diǎn)由低到高順序流出，若樣品中 兼有極性和非極性組分，則同沸點(diǎn)的極性組分先出峰。常用的固定液有角 鯊?fù)椋ó惾椋⑵に傻?。適用于非極性和弱極性化合物的分析。20中等極性

19、固定液 ：由較大的烷基和少量的極性基團(tuán)或可以誘導(dǎo)極化的基團(tuán)組成，它們與待測(cè)物質(zhì)分子間的作用力以色散力和誘導(dǎo)力為主，組分 基本上按沸點(diǎn)順序出峰，同沸點(diǎn)的非極性組分先出峰。常用的固定液有鄰 苯二甲酸二壬酯、聚酯等，適用于弱極性和中等極性化合物的分析。21強(qiáng)極性固定液：含有較強(qiáng)的極性基團(tuán)，它們與待測(cè)物質(zhì)分子間作用力以 靜電力和誘導(dǎo)力為主，組分按極性由小到大的順序出峰。常用的固定液有 氧二丙腈等，適用于極性化合物的分析。22氫鍵型固定液：是強(qiáng)極性固定液中特殊的一類，與待測(cè)物質(zhì)分子間作用力以氫鍵力為主，組分依形成氫鍵的難易程度出峰，不易形成氫鍵的組分先出峰。常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等，適用于分析

20、含F(xiàn)、N、O等的化合物。23固定液的選擇：按極性相似原則選擇：極性相似，溶解度大，分配系數(shù)大，保留時(shí)間長(zhǎng)：按官能團(tuán)相似選擇：酯類-酯或聚酯類固定液；醇類-聚乙二醇固定液。按主要差別選擇：各組分間沸點(diǎn)是主要差別-非極性固定液；極性為主要差別-極性固定液。選擇混合固定液：對(duì)于難分離 的復(fù)雜樣品，可選用兩種或兩種以上固定液。24聚合物固定相：既可作為固體固定相，也可作為載體，又稱高分子多孔 微球。物質(zhì)在其表面既存在吸附作用，又存在溶解作用。（1）具有較大的比表面積，表面孔徑均勻（2）對(duì)非極性及極性物質(zhì)無有害的吸附活性，拖尾現(xiàn) 象小，極性組分也能出對(duì)稱峰（3）由于不存在液膜，無流失現(xiàn)象，熱穩(wěn)定性好（4

21、）機(jī)械強(qiáng)度和耐腐蝕性較好，系均勻球形，在填充柱色譜中均勻性、重 現(xiàn)性好，有助于減少渦流擴(kuò)散。25載氣種類的選擇：檢測(cè)器的適應(yīng)性；載氣流速的大小。26柱溫的選擇：（1）首先應(yīng)使柱溫控制在固定液的最高使用溫度（超過該溫度固定液易流失 ）和最低使用溫度（低于此溫度固定液以固體形式存在）范圍之內(nèi)。(2) 提高柱溫，可以改善傳質(zhì)阻力，有利于提高柱效，縮短分析時(shí)間，但降 低了容量因子和選擇性，不利于分離。一般的原則是：在使最難分離的組 分盡可能分離的前提下，盡量采用較低的柱溫，但以保留時(shí)間適宜，峰形 不拖尾為度。(3) 柱溫一般選擇在接近或略低于組分平均沸點(diǎn)時(shí)的溫度。(4) 組分復(fù)雜，沸程寬的試樣，采用程

22、序升溫。27載體和固定液含量的選擇：配比：固定液在載體上的涂漬量，一般指的 是固定液與擔(dān)體的百分比， 填充柱的配比通常在 5%25%之間。配比越低, 擔(dān)體上形成的液膜越薄，傳質(zhì)阻力越小，柱效越高，分析速度也越快。配 比較低時(shí)，固定相的負(fù)載量低，允許的進(jìn)樣量較小。分析工作中通常傾向 于使用較低的配比。28進(jìn)樣條件的選擇：進(jìn)樣量應(yīng)控制在柱容量允許范圍及檢測(cè)器線性檢測(cè)范 圍之內(nèi)。進(jìn)樣要求動(dòng)作快、時(shí)間短；氣化室一般較柱溫高 3070 OCO29提高色譜分離能力的途徑： 塔板理論：增加柱長(zhǎng)，減小柱徑，即增 加柱子塔板數(shù)；(2)速率理論：減小組分在柱中的渦流擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力，可降 低塔板高度。30毛細(xì)管色譜

23、柱的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(1) 不裝填料阻力小，長(zhǎng)度可達(dá)百米的毛細(xì)管柱，管徑0.2mm。：(2) 氣流單途徑通過柱子，消除了組分在柱中的渦流擴(kuò)散。(3) 固定液直接涂在管壁上，總柱內(nèi)壁面積較大，涂層很薄，則氣相和液相傳質(zhì)阻力大大降低。(4) 毛細(xì)管色譜柱柱效高達(dá)每米30004000塊理論塔板，一支長(zhǎng)度100米的毛細(xì)管柱，總的理論塔板數(shù)可達(dá)104106。31、毛細(xì)管色譜具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1) 分離效率高：比填充柱高10100倍；(2) 分析速度快：用毛細(xì)管色譜分析比用填充柱色譜速度(3) 色譜峰窄、峰形對(duì)稱。較多采用程序升溫方式；(4) 靈敏度高，一般采用氫焰檢測(cè)器。(5) 渦流擴(kuò)散為零。32、毛細(xì)管色譜的

24、類型：(1) 涂壁毛細(xì)管柱：將固定液直接涂敷在管內(nèi)壁上。柱制作相對(duì)簡(jiǎn)單，但柱 制備的重現(xiàn)性差、壽命短。(2) 多孔層毛細(xì)管柱：在管壁上涂敷一層多孔性吸附劑固體微粒。構(gòu)成毛細(xì) 管氣固色譜。(3) 載體涂漬毛細(xì)管柱：將非常細(xì)的擔(dān)體微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效較涂壁毛細(xì)管柱高。(4) 化學(xué)鍵合或交聯(lián)毛細(xì)管柱：將固定液通過化學(xué)反應(yīng)鍵合在管壁上或交聯(lián) 在一起。使柱效和柱壽命進(jìn)一步提高。高效液相色譜法(HPLC)1與氣相色譜相比液相色譜的優(yōu)點(diǎn)：與氣相色譜法相比，液相色譜法不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性及相對(duì)分子質(zhì)量的限制，只要求把樣品制成溶液即 可，非常適合于分離生物大分子、離子型化合物，不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物

25、以及 其他各種高分子化合物等。此外，液相色譜的流動(dòng)相不僅起到使樣品沿色 譜柱移動(dòng)的作用，而且與固定相一樣， 與樣品分子發(fā)生選擇性的相互作用， 這就為控制和改善分離條件提供了一個(gè)額外的可變因素。而氣相色譜法采 用的流動(dòng)相是惰性氣體，對(duì)組分沒有親和力，僅起運(yùn)載作用。2液相色譜特點(diǎn)：?jiǎn)J壓、咼速、咼效、咼靈敏度、咼沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī) 及生化試樣的高效分離分析方法。3高效液相相色譜儀的組成：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。4流動(dòng)相使用前必須脫氣。常用的脫氣方法有：低壓脫氣法(電磁攪拌、水泵抽空，可同時(shí)加熱或向溶劑吹氮?dú)?、吹氦氣脫氣法和超聲波脫氣法等。5梯度洗脫：用兩種（或多種

26、）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動(dòng)相中溶劑的配比和極性，通過流動(dòng)相中極性的變化來改變被 分離組分的分離因素，以提高分離效果。6高壓梯度（內(nèi)梯度）：特點(diǎn)是先加壓后混合。將溶劑用高壓泵增壓以后輸入色譜系統(tǒng)的梯度混合室，加以混合后送入色譜柱。低壓梯度（外梯度）：特點(diǎn)是先混合后加壓。在常壓下預(yù)先按一定的程序 將溶劑混合后再用泵輸入色譜柱。7進(jìn)樣系統(tǒng) 要求：良好的密圭寸性，最小的死體積，最好的穩(wěn)定性，進(jìn)樣 時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)壓力、流量影響較小。8分離系統(tǒng)：色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件。由柱管和固定相組成。柱管為直型不銹鋼管。一般色譜柱長(zhǎng)530 Cm ,內(nèi)徑45 mm ,凝膠色譜柱內(nèi)徑312 m

27、m ,而制備色譜柱內(nèi)徑則可達(dá)25 mm。一般淋洗溶劑在進(jìn)入色譜分離柱之前，先通過前置柱。HPLC柱的填料顆粒粒徑一般約為310m，填充常采用勻漿法。 色譜柱的發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱 效。9檢測(cè)系統(tǒng)：作用一一用來連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含 量變化的裝置。紫外-可見吸收檢測(cè)器、光電二極管陣列檢測(cè)器、示差折光 檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器。10高效液相色譜法對(duì)流動(dòng)相的要求：流動(dòng)相不與色譜柱發(fā)生不可逆化學(xué)變化，以保持柱效或柱子的保留性質(zhì)較長(zhǎng)時(shí)間不變；對(duì)待測(cè)樣品有足夠的溶解能力；與所用檢測(cè)器相匹配；粘度盡可能小，以獲得較高的柱效；流動(dòng)相純度 要高，價(jià)格便宜，毒性小。11高

28、效液相色譜法的固定相的分類：(1) 按固定相承受壓力分：剛性固體：以二氧化硅為基質(zhì)， 可承受較高壓力，表面可鍵合各種功能官能團(tuán) -鍵合固定相，是目前應(yīng)用最廣泛的固定相。硬膠：主要用于離子交換色譜法和凝膠色譜法中，由聚苯乙烯與二乙烯基 苯交聯(lián)而成，可承受的壓力較低。(2) 按孔隙深度分：表面多孔型：基體是球形玻璃珠，在玻璃表面涂覆一層 多孔活性物質(zhì)如硅膠、氧化鋁、聚酰胺、離子交換樹脂、分子篩等。優(yōu)點(diǎn)： 適用于快速分離、填充均勻緊密、機(jī)械強(qiáng)度高、能承受高壓，適于簡(jiǎn)單的 樣品及常規(guī)分析：缺點(diǎn)：多孔層薄，進(jìn)樣量受限制。全多孔型：由硅膠顆粒 聚集而成，比表面積大，柱容量大，小顆粒全孔型固定相孔洞淺傳質(zhì)速

29、率 快，柱效高，分離效果好，適合于復(fù)雜樣品、痕量組分的分離分析，是目前HPLC中應(yīng)用最廣泛的固定相。12液固吸附色譜法原理：是以固體吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中 心具有吸附能力，試樣分子被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)時(shí)，它將與流動(dòng)相溶劑分子 在吸附劑表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附。分離過程是一個(gè)吸附-解吸的平衡過程。13液固吸附色譜法固定相：通常是硅膠、氧化鋁、活性炭等固體吸附劑。硅膠最常用。流動(dòng)相：極性大的試樣需用極性強(qiáng)的洗脫劑，極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。應(yīng)用：幾何異構(gòu)體分離和族分離，如農(nóng)藥異構(gòu)體；石油中烷、烯、芳烴的分離。不適于強(qiáng)極性的離子型樣品的分離，不適于 分離同系物（因?yàn)樗鼘?duì)相對(duì)分子質(zhì)量的選擇性較小

30、）。14液液分配色譜法原理：根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶（或部分互溶）的液體中 溶解度的不同實(shí)現(xiàn)分離。分配系數(shù)較大的組分保留值也較大。15液液分配色譜法流動(dòng)相：流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者二者的極性相差越大越好。根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜（流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于強(qiáng)極性和中等極性組分分離）和反相分配色譜（流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性或弱極性組分分離）。固定相：由載體和固定液組成。常用的固定液有 b,b '-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、 角鯊?fù)榈?。?yīng)用：同系物組分的分離。例：分離水解蛋白質(zhì)所生成的各

31、種氨基酸，分離脂肪酸同系物等。16化學(xué)鍵合固定相：化學(xué)鍵合固定相是利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成各種性能的固定相。17化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)：固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高；能耐受各種溶劑，可用于梯度洗脫；表面較為均一。沒有液坑，傳質(zhì)快，柱效高;能鍵合不同基團(tuán)以改變其選擇性。例如，鍵合氰基、氨基等極性集團(tuán)用于正相色譜法，鍵合離子交換基團(tuán)用于離子色譜法，鍵合C2 , C4 , C6 ,C8 , C18 , C16 , C18 , C22烷基和苯基等非極性基團(tuán)用于反相色譜法等。 因此，它是 HPLC較為理想的固定相。18離子交換色譜法原理：離子交換色譜

32、法的固定相是離子交換樹脂，流動(dòng)相是水溶液，它是利用待測(cè)樣品中各組分離子與離子交換樹脂的親和力 的不同而進(jìn)行分離的。19離子交換色譜法流動(dòng)相：水的緩沖溶液。陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。20凝膠色譜法原理 ：凝膠色譜法的固定相為多孔性凝膠類物質(zhì)，流動(dòng)相 為水溶液或有機(jī)溶劑，它是根據(jù)不同組分分子體積的大小進(jìn)行分離的。小 分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在

33、 100-105范圍內(nèi)的化合 物按質(zhì)量分離。21凝膠色譜法流動(dòng)相：能溶解樣品且與凝膠相似（潤(rùn)濕凝膠并防止吸附作 用）、粘度?。ㄔ黾訑U(kuò)散速度）。常用四氫呋喃、苯、氯仿、水等。22影響分離的因素與提高柱效的途徑：（1）液體的黏度比氣體大一百倍， 密度為氣體的一千倍左右，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。（2）由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。（3）液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。（4）恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。（5）流速大于0.5 cm/s時(shí),HU曲線是一段斜率不大的直線。降低流速， 柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí) 間的重要可

34、選擇參數(shù)。（6）氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜， 其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng) 技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。質(zhì)譜分析法（MS）1質(zhì)譜法定義：是將待測(cè)物質(zhì)置于離子源中電離形成帶電離子，讓離子加速并通過磁場(chǎng)或電場(chǎng)后，離子將按質(zhì)荷比（mz）大小分離，形成質(zhì)譜圖。依據(jù)質(zhì)譜線的位置和質(zhì)譜線的相對(duì)強(qiáng)度建立的分析方法稱為質(zhì)譜法。2質(zhì)譜的作用：準(zhǔn)確測(cè)定物質(zhì)的分子量；質(zhì)譜法是唯一可以確定分子式的方 法;根據(jù)碎片特征進(jìn)行化合物的結(jié)構(gòu)分析。3質(zhì)譜分析的基本原理：質(zhì)譜法是利用電磁學(xué)原理，將待測(cè)樣品分子解離成具有不同質(zhì)量的離子，然后按其質(zhì)荷比（mz）的大小依次

35、排列收集成質(zhì)譜。根據(jù)質(zhì)譜中的分子離子峰 （M +）可以獲得樣品分子的相對(duì)分子質(zhì)量信息；根據(jù)各離子峰（分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重 排離子峰等）及其相對(duì)強(qiáng)度和氮數(shù)規(guī)則，可以確定化合物的分子式；根據(jù)各離子峰及物質(zhì)化學(xué)鍵的斷裂規(guī)律可以進(jìn)行定性分析和結(jié)構(gòu)分析；根據(jù)組分質(zhì)譜峰的峰高與濃度間的線性關(guān)系可以進(jìn)行定量分析。4質(zhì)譜分析的過程 ：（1）進(jìn)樣，化合物通過汽化引入電離室；（2）離子化，在電離室，組分分子被一束加速電子碰撞，撞擊使分子電離形成正離子；（3）離子也可因撞擊強(qiáng)烈而形成碎片離子；（4）荷正電離子被加速電壓V加速，產(chǎn)生一定的速度 V ,與質(zhì)量、電荷及加速電壓有關(guān)；（5）加

36、速正離子進(jìn)入一個(gè)強(qiáng)度為 B的磁場(chǎng)（質(zhì)量分析器），發(fā)生偏轉(zhuǎn)。5質(zhì)譜儀的組成 ：真空系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源或電離室、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器。6真空系統(tǒng)作用 ：是減少離子碰撞損失。若真空度低：大量氧會(huì)燒壞離子源的燈絲；會(huì)使本底增高，干擾質(zhì)譜圖 ；引起額外的離子-分子反應(yīng)，改變裂 解模型，使質(zhì)譜解釋復(fù)雜化 ；干擾離子源中電子束的正常調(diào)節(jié)；用作加速離子的幾千伏高壓會(huì)引起放電等。7進(jìn)樣系統(tǒng)目的：高效重復(fù)地將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度 的降低。間歇式進(jìn)樣系統(tǒng)一一氣體及低沸點(diǎn)、易揮發(fā)的液體；直接探針進(jìn)樣高沸點(diǎn)的液體、固體 ；色譜進(jìn)樣系統(tǒng)有機(jī)化合物。8離子源或電離室：作用是使試樣中的原子、分子電離成離

37、子，其性能影響質(zhì)譜儀的靈敏度和分辨率本領(lǐng)。8電子電離源的特點(diǎn)：電離電壓：70eV;加一小磁場(chǎng)增加電離幾率 ；El源電離效率高，碎片離子多，結(jié)構(gòu)信息豐富，有 標(biāo)準(zhǔn)化合物質(zhì)譜庫；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便；樣品在氣態(tài)下電離，不能汽化的樣 品不能分析，主要用于氣 -質(zhì)聯(lián)用儀；有些樣品得不到分子離子。9化學(xué)電離源特點(diǎn)：電離能小，質(zhì)譜峰數(shù)少，譜圖簡(jiǎn)單；最強(qiáng)峰為(M+1)+準(zhǔn)分子離子峰；不適用難揮發(fā)試樣。10快原子轟擊源：高能量的Xe原子轟擊涂在靶上的樣品， 濺射出離子流。 本法適合于高極性、大分子量、低蒸汽壓、熱穩(wěn)定性差的樣品。FAB 般用作磁式質(zhì)譜的離子源。11電噴霧源結(jié)構(gòu)：噴嘴(金屬毛細(xì)管)，霧化氣，干燥氣。原理：噴霧蒸發(fā) 電壓。特點(diǎn)：ESl是最軟的一種電離方式，只產(chǎn)生分子離子，不產(chǎn)生碎片離 子;適用于強(qiáng)極性，大分子量的樣品分析，如肽，蛋白質(zhì)，糖等；產(chǎn)生的離子帶有多電荷，尤其是生物大分子；主要用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，既用作液相色譜和質(zhì)譜儀之間的接口裝置，同時(shí)又是電離裝置。12場(chǎng)致電離源(FI)和場(chǎng)解吸電離源(FD):分子離子峰強(qiáng)；:碎片離子峰少: 不適合化合物結(jié)構(gòu)鑒定。13基質(zhì)輔助激光解吸電離特點(diǎn)：準(zhǔn)分子離子峰很強(qiáng)，且碎片離子少。通常用于飛行時(shí)間質(zhì)譜，特別適合測(cè)定多肽、蛋白質(zhì)、DNA片段、多糖等的相對(duì)分子質(zhì)