植物過氧化氫(H2O2)說明書

1、個人收集整理僅供參考學(xué)習(xí)5本文由上海哈靈生物科技有限公司提供上海哈靈試劑供應(yīng)商感謝您閱讀本文植物過氧化氫（H2O2）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定植物組織，細(xì)胞及相關(guān)液體樣本中過氧化氫（H2O2）的含量實驗原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中植物過氧化氫（H2O2）水平。用純化的植物過氧化氫（H2O2）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入過氧化氫（H2O2）,再與HRP標(biāo)記的過氧化氫（H2O2）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)

2、化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的過氧化氫（H2O2）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中植物過氧化氫（H2O2）濃度。試劑盒組成試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份封板膜2片(48)2片(96)密封袋1個1個酶標(biāo)包被板1X481X962-8C保存標(biāo)準(zhǔn)品：1800ng/ml0.5mlX1瓶0.5mlX1瓶2-8C保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5mlX1瓶1.5mlX1瓶2-8C保存酶標(biāo)試劑3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存樣品稀釋液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存顯色劑A液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存顯色劑B液3mlx1瓶6mlx1

3、瓶2-8C保存終止液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存濃縮洗滌液(20mlX20倍)X1瓶(20mlx30倍)x1瓶2-8C保存樣本處理及要求：1.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2-8C的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。2 .標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.3 .不能檢測含NaN3的樣品，因N

4、aN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟：1 .標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100M,然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液504,混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100d分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50小混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50M棄掉，再各取50M分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50M分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50人混勻后從第七、第八孔中分別取50M加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加

5、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50口，混勻后從第九第十孔中各取50日棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50M,濃度分別為1200ng/ml,800ng/ml,400ng/ml,200ng/ml,100ng/ml）。2 .加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40M,然后再加待測樣品10U（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3 .溫育:用封板膜封板后置37c溫育30分鐘。4 .配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸儲水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。5 .洗滌：小心揭掉封板膜，

6、棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6 .加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑504，空白孔除外。7 .溫育:操作同3。8 .洗滌：操作同5。9 .顯色：每孔先加入顯色劑A50U,再加入顯色劑B50M,輕輕震蕩混勻，37c避光顯色15分鐘.10 .終止：每孔加終止液50口終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11 .測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。注意事項：1 .試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2 .濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在

7、水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。3 .各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 .請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX5）o5 .封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6 .底物請避光保存。7 .嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)8 .所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9 .本試劑不同批號組分不得混用。10 .如與英文說明書

8、有異，以英文說明書為準(zhǔn)。（此圖僅供參考）計算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。試劑盒性能：1 .樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上。2 .批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和15%檢測范圍：40ng/ml-1600ng/ml保存條件及有效期：1 .試劑盒保存：；2-8C。2 .有效期：6個月PlantH2O2FORRESEARCHUSEONLYDrugNamesGene

9、ricNamePlantH2O2ELISAKit.PurposeThiskitallowsforthedeterminationofH2O2concentrationsinPlanttcsIUculturesupernatantandotherbiologicalfluids.PrincipleoftheassayThekitassayPlantH2O2levelinthesampusePurifiedPlantH2O2tocoatmicrotiterplatewells,makesolid-phaseantibody,thenaddH2O2towells,CombinedH2O2whichW

10、ithHRPlabeled,becomeantibody-antigen-enzyme-antibodycomplex,afterwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRPenzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyitawavelengthof450nm.Theconcentration

11、ofH2O2inthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothestandardcurve.MaterialsprovidedwiththekitMaterialsprovidedwiththekit48determinations96determinationsStorageUsermanual11Closureplatemembrane22Sealedbags11Microelisastripplate112-8CStandard1800ng/ml0.5ml1Xbottle0.5ml1Xbottle2-8CStand

12、arddiluent1.5ml1Xbottle1.5ml1Xbottle2-8CHRP-Conjugatereagent3ml1bottle6ml1bottle2-8CSamplediluent3ml1bottle6ml1bottle2-8CChromogenSolutionA3ml1bottle6ml1bottle2-8CChromogenSolutionB3ml1bottle6ml1bottle2-8CStopSolution3ml1bottle6ml1bottle2-8Cwashsolution(20mlx20folcDx1bottle(20mlx30folcDx1bottle2-8CS

13、pecimenrequirements1. TissuesamplesAftercuttingsamples,checktheweight,addPPBS7.2-7.4,Rapidlyfrozenwithliquidnitrogen,maintainsamplesaC2-aftermelting,addPBSPH7.4,HomogenizedbyhandorGrinders,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant.2. extractassoonaspossibleafterSpecimencollect

14、ion,andaccordingtotherelevantliterature,andshouldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextractionIfitcant,specimencanbekeptin-20topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.3. CantdetectthesamplewhichconaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.Assayprocedure個人收集整理僅供參考學(xué)習(xí)1 .DiluteandaddsampletoStandard:set10Standa

15、rdwellsontheELISAplatescoated,addStandard100111tothefirstandthesecondwell,thenaddStand50didilUrtittnefirstandthe second well, mix; take out 1001l fcthe seEcoindtwedd then add it to the thirdandtheforthwellseparatelythenaddStandarddilution50iitothethirdandtheforthwell ,mix ; then take out 50nlfromthe

16、thirdandtheforthwelldiscard,add50thesixthwell,thenaddStandarddili50)nltothefifthandthesixthwell,mix;takeout50fromthefifthandthesixthwellandaddtotheseventhandtheeighthwell,thenaddStandarddilution50仙ltotheseventhandtheeighthwell,mix;takeout50nthandthelfromtheseveeighthwellandaddtotheninthandthetenthwe

17、ll,addStandard50lutionotheninthandthetenthwell,mix,takeout50仙lfromtheninthandthetenthwelldiscard(addSample5eachwellafterDiluting,(denslity)0ng/ml,800ng/ml,400ng/ml,200ng/ml,100ng/ml)2 .addsampleSetblankwellsseparately(blankcomparisorwellsdonaddsampleandHRP-Conjugatereagent,othereachstepoperationissa

18、me).testingsamplewell.addSampledilution40ptbtestingsamplewel,thenaddtestingsample10仙Qsamplefinaldilutionis5-fold),addsampletoweldonttouchthewellwallasfaraspoasdbGentlymix.1 .Incubate:AfterclosingplatewithClosureplatemembrane,incubatefor30Cminat374.Configurateliquid:30-fold(or20-fold)washsolutiondilu

19、ted30-fold(or20-fold)withdistilledwaterandreserve.5 .washingUncoverClosureplatemembrane,discardLiquid,drybyswing,addwashingbuffertoeverywell,stillfor30sthendrain,repeat5times,drybypat.6 .addenzymeAddHRP-Conjugatereagent仙ltoeachwell,excebtankwell.7.incubateOperationwith3.8.washingOperationwith5.9.col

20、orAddChromogenSolutionA50ulandChromogenSolutionBtoeachwell,evadethelightpreservationfor15minat23710.StopthereactionAddStopSolutio50ptoeachwell,Stopthereaction(the)luecolorchangetoyellowcolor).11.assaytakeblankwellaszero,Readabsorbanceat450nmafterAddingStopSolutionandwithin15min.Importantnotes1. Thek

21、ittakesoutfromtherefrigerationenvironmentshouldbebalanced15-30minutesintheroomtemperature,ELISAplatescoatedifhasnotuseupafteropened,theplateshouldbestoredinSealedbag.2. washingbufferwillCrystallizatiorseparationjtcanbeheatedthewaterhelpsdissolvewhendilute.Washingdoesnotaffecttheresult.3. addSamplewi

22、thsamplerEachstep,Andproofreaditsaccuracyfrequently,avoidstheexperimentalerror.addsamplewithin5mins,ifthenumberofsampleismuch,recommendtouseVolley.4. ifthetestingmaterialcontentisexcessivelyhigher(ThesampleODisbiggerthanthefirststandardwell),pleasediluteSample(n-fold),Pleasediluenteandmultipliedbythedilutionfactor.(n5).5. Closureplatemembraneonlylimitsthedisposableuse,toavoidcross-contamination.6. Thesubstrateevadethelightpreservation7. Pleaseaccordingtouseinst