霉菌與酵母菌計(jì)數(shù)方法(2015版藥典)

1、霉菌與酵母菌計(jì)數(shù)方法1試驗(yàn)菌液的制備和使用（以白色念珠菌為示例）白色念珠菌（0）代傳代培育試驗(yàn)菌液的制備：沙氏葡萄糖瓊脂培育基或沙氏葡萄糖液體培育基，培育溫度2025，培育時(shí)間23天計(jì)數(shù)培育基適用性檢查：胰酪大豆胨瓊脂培育基，培育溫度3035，培育時(shí)間不超過(guò)5天，接種量不大于100cfu計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)：胰酪大豆胨瓊脂培育基（MPN法不適用），培育溫度3035，培育時(shí)間不超過(guò)5天，接種量不大于100cfu注：當(dāng)需用玫瑰紅鈉瓊脂培育基測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培育基適用性檢查，檢查方法同沙氏葡萄糖瓊脂培育基1.1菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），

2、并接受適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。1.2菌液制備（按表1規(guī)定程序培育各試驗(yàn)菌株）取白色念珠菌的新穎培育物用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液取黑曲霉的新穎培育物加入35ml含0.05聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫接受適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)用含0.05聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時(shí)內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在28，

3、在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。1.3陰性對(duì)比為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)比試驗(yàn)，陰性對(duì)比試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如陰性對(duì)比有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。2.培育基適用性檢查按表1規(guī)定，接種不大于100cfu的菌液至沙氏葡萄糖瓊脂培育基平板置表1規(guī)定條件下培育每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)比培育基替代被檢培育基進(jìn)行上述試驗(yàn)被檢固體培育基上的菌落平均數(shù)與對(duì)比培育基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)比培育基上的菌落全都；被檢液體培育基管與對(duì)比培育基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好3計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試液制備：水不溶性非油脂類供試品取供試品，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-

4、蛋白胨緩沖液，或pH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培育基制備成1:10供試液。若需要，調(diào)整供試液pH值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。接種和稀釋 所加菌液的體積應(yīng)不超過(guò)供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。試驗(yàn)組供試品對(duì)比組菌液對(duì)比組取上述制備好的供試液加入試驗(yàn)菌液，混勻使每1ml供試液中含菌量不大于100cfu取制備好的供試液加入稀釋液，混勻使每1ml供試液中含菌量不大于100cfu取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液加入試驗(yàn)菌液，混勻使每1ml供試液中含菌量不大于100cfu4抗菌活性

5、的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)比組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)比組菌數(shù)值的50%，可接受下述方法消退供試品的抑菌活性。1 加稀釋液或培育基體積。2 入適宜的中和劑或滅活劑接受薄膜過(guò)濾法。5供試品中微生物的回收表1所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。微生物的回收可接受平皿法、薄膜過(guò)濾法或MPN法。(預(yù)方法是平皿法)平皿法包括傾注法和涂布法。表1中每株試驗(yàn)菌每種培育基至少制備2個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。（1）傾注法取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的去除或滅活”制備的供試液1ml置直徑90

6、mm的無(wú)菌平皿中注入1520ml溫度不超過(guò)45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培育基混勻，凝固，倒置培育。（若使用直徑較大的平皿，培育基的用量應(yīng)相應(yīng)增加）按表1規(guī)定條件培育、計(jì)數(shù)同法測(cè)定供試品對(duì)比組及菌液對(duì)比組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。（2）涂布法取1520ml溫度不超過(guò)45的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培育基注入直徑90mm的無(wú)菌平皿，凝固，制成平板接受適宜的方法使培育基表面干燥(若使用直徑較大的平皿，培育基用量也應(yīng)相應(yīng)增加)每一平板表面接種上述照“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml按表1規(guī)定條件培育、計(jì)數(shù)同法測(cè)定供試品對(duì)比組及菌液對(duì)比組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)6.結(jié)果推斷計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，接受平皿法或薄膜過(guò)濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)比組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)比組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。7.供試品檢查（1）除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；（2）胰酪大豆胨瓊脂培育基或胰酪大豆胨液體培育基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培育基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。（3）培育和計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培育基平