微生物限度方法學(xué)驗證

1、微生物限度檢查方法學(xué)驗證一、檢驗方法依據(jù)微生物計數(shù)法（中國藥典2015年版四部1105）；控制菌檢查法（中國藥典2015年版四部1106）；非無菌藥品微生物限度標準（中國藥典2015年版四部1107）；抑菌效力檢查法（中國藥典2015年版四部1121）檢查。二、菌種、培養(yǎng)基及稀釋液表1菌種菌種名稱菌種代數(shù)菌種狀態(tài)廠家大腸埃希菌 CMCC(B)441023正常浙江省食品藥品檢驗研究院金黃色葡萄球菌CMCC(B)260033正?？莶菅挎邨U菌CMCC(B)635013正常白色念珠菌CMCC(F)980013正常黑曲霉CMCC(F)980033正常乙型副傷寒沙門菌CMCC(B)500943正常表2培養(yǎng)

2、基培養(yǎng)基名稱批號廠家營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基150222北京三藥科技開發(fā)公司改良馬丁培養(yǎng)基150134北京三藥科技開發(fā)公司改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基150215北京三藥科技開發(fā)公司營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基150317北京三藥科技開發(fā)公司玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基150323北京三藥科技開發(fā)公司膽鹽乳糖培養(yǎng)基150127北京三藥科技開發(fā)公司膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基150214北京三藥科技開發(fā)公司四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基150416北京三藥科技開發(fā)公司MUG培養(yǎng)基150122北京三藥科技開發(fā)公司曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基150137北京三藥科技開發(fā)公司三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基150207北京三藥科技開發(fā)公司表3對照用培養(yǎng)基對照培養(yǎng)基名稱批號廠家營養(yǎng)肉湯對照

3、培養(yǎng)基135004-201103中國食品藥品檢定研究院營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基135003-201002中國食品藥品檢定研究院玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基135005-201002中國食品藥品檢定研究院膽鹽乳糖對照培養(yǎng)基135006-201404中國食品藥品檢定研究院膽鹽硫乳瓊脂對照培養(yǎng)基135010-201102中國食品藥品檢定研究院四硫磺酸鈉亮綠對照培養(yǎng)基135020-201101中國食品藥品檢定研究院MUG對照培養(yǎng)基135012-201001中國食品藥品檢定研究院曙紅亞甲藍瓊脂對照培養(yǎng)基135009-201102中國食品藥品檢定研究院三糖鐵瓊脂對照培養(yǎng)基表4試劑試劑名稱批號級別磷酸二氫鉀130826

4、分析純氫氧化鈉20150117分析純氯化鈉20140714分析純聚山梨酯8020141011化學(xué)純95%乙醇15070722藥用級二甲氨基苯甲醛20140402分析純鹽酸20140533分析純稀釋液：（1）pH6.8緩沖液 取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml,加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118ml,用水稀釋至1000ml，搖勻，既得。（2）0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝、滅菌。（3）0.05（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液取聚山梨酯80 0.5ml，用0.9無菌氯化鈉溶液溶解并稀釋至1000ml，濾過，分裝，滅菌，備用。

5、（4）靛基質(zhì)試液 取對二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取鹽酸20ml徐徐滴入。三、菌液的制備1細菌、霉菌、酵母菌接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7天，加入5ml含0.05（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液（用帶有無菌棉花的能過濾菌絲的無菌毛細吸管）用0.9%

6、無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50100cfu的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在28可在24小時內(nèi)使用。2控制菌接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10100cfu的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在28可在24小時內(nèi)使用。四、驗證內(nèi)容1、計數(shù)方法驗證將制備好的菌懸液用0.9%無菌氯化鈉溶液以每10倍體積分別稀釋成一系列濃度菌懸液，利用血球計數(shù)板計數(shù)，確定具體菌懸液濃度，取接近于10cfu-100cfu的稀釋濃度，選取各項試驗項下的規(guī)定濃度進

7、行實驗。稀釋及觀察均應(yīng)在陽性室內(nèi)完成。經(jīng)過驗證當原液稀釋至10-6時，菌液濃度接近100cfu/ml。2、適用性檢查2.1細菌、霉菌、酵母菌取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各1ml(內(nèi)含菌約50100cfu)，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)48小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(內(nèi)含菌約50100cfu)，注入無菌平皿中（取用黑曲霉時應(yīng)注意自身安全），立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置2328培養(yǎng)72小時，計數(shù)。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗，作為對照。其大

8、小、形態(tài)應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致，且數(shù)量應(yīng)不小于對照培養(yǎng)基的70%。細菌、霉菌及酵母菌培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱菌種名稱測試培養(yǎng)基（cfu）對照培養(yǎng)基（cfu）回收率(%)大小形態(tài)標準結(jié)論碟1碟2平均碟1碟2平均營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌87838595999787.6一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定金黃色葡萄球菌88828594989688.5一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定大腸埃希菌838684.595959588.9一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌848785.5999496.588.6一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定金黃色葡萄球菌908688

9、971019988.9一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定大腸埃希菌888385.5929995.589.5一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定培養(yǎng)基中細菌、霉菌、酵母菌的生長情況良好，回收率在80%，且與對照培養(yǎng)基狀態(tài)一致，證明此批次培養(yǎng)基可以準確的檢測出相應(yīng)微生物情況。2.2控制菌2.2.1促生長能力取大腸埃希菌菌懸液0.1ml（內(nèi)含菌約10100cfu），分別置于膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中；取乙型副傷寒沙門菌0.1ml（內(nèi)含菌約10100cfu），分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基，取乙型副傷寒沙門菌0.1ml（內(nèi)含菌約10100cfu）涂布于膽鹽硫乳

10、瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基中；于35培養(yǎng)18小時，同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗，作為對照，每個培養(yǎng)基平行制備2個平皿。膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基與對照管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應(yīng)生長良好；膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。2.2.2抑制能力取金黃色葡萄球菌100 cfu左右，注入無菌平皿中，立即傾注膽鹽乳糖培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基平行制備2個平皿，混勻，凝固，置35培養(yǎng)18小時，應(yīng)不得有菌生長。2.2.3指示能力取乙型副傷寒沙門菌10100cfu，接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)

11、基平行制備2個平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)18小時；膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基指示能力見2.2.1中乙型副傷寒沙門菌測試結(jié)果，MUG培養(yǎng)基指示能力見2.2.1中大腸埃希菌測試結(jié)果。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反映情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致?？刂凭囵B(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱促生長性（與對照比較）抑制性（與對照比較）金黃色平葡萄球菌指示性（與對照比較）乙型副傷寒沙門菌結(jié)論菌種名稱形態(tài)大小形態(tài)大小指示反應(yīng)膽鹽乳糖培養(yǎng)基大腸埃希菌一致一致無生長-符合規(guī)定MUG培養(yǎng)基大腸埃希菌一致一致-一致一致一致符合規(guī)定營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基大腸埃希菌一致一致-符合規(guī)

12、定乙型副傷寒沙門菌一致一致-符合規(guī)定四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基乙型副傷寒沙門菌一致一致無生長-符合規(guī)定膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基乙型副傷寒沙門菌一致一致-一致一致一致符合規(guī)定曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基乙型副傷寒沙門菌一致一致-一致一致一致符合規(guī)定三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基-一致一致一致符合規(guī)定培養(yǎng)基的促生長性及指示性菌落生長狀態(tài)一致，抑制性均無菌落生長，說明培養(yǎng)基適用性良好。3、抑菌性：取連續(xù)生產(chǎn)的三批樣品進行測定3.1細菌 、霉菌、酵母菌3.1.1供試液的制備：稱取本品10g，加pH6.8緩沖液100ml，混勻，制成1：10的供試液。3.1.2試驗組：取大腸埃希菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液和枯草芽孢桿菌菌懸液各1ml，

13、分別加上述供試液1ml，注入平皿中，立即傾注1520ml溫度不超過45溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。31.3菌液組：取上述各試驗菌液1ml，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。3.1.4供試品對照組：取供試液1ml，分別注入1520ml溫度不超過45溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個培養(yǎng)基平行制備2個平皿。3.1.5回收率標準以供試品對照組為樣品空白(C0)、以菌液組為對照(T)、以試驗組為測試品(C)計：(C-C0)/T70%細菌、霉菌及酵母菌抑菌性檢測結(jié)果統(tǒng)計批號培養(yǎng)基名稱菌種培養(yǎng)時間（h）菌液組

14、菌數(shù)Cfu試驗組菌數(shù)Cfu供試品對照組菌數(shù)回收率%數(shù)值平均數(shù)值平均數(shù)值平均150804營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌7284869092.581095.9728895金黃色葡萄球菌7286849391.597.072829012大腸埃希菌728485.5919295.9728793玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌1208686.584850098.31208786金黃色葡萄球菌1208787.5858698.312088870大腸埃希菌1208785.5838397.11208483150805營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌7288859592.56597.1728690金黃色葡萄球菌728584.5959

15、3.595.57284924大腸埃希菌728184.58991.597.7728794玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌12083858787.50097.11208788金黃色葡萄球菌12086848886.597.112082850大腸埃希菌1208884868895.51208090150806營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌728785.59495.56695.5728497金黃色葡萄球菌728386969695.67289966大腸埃希菌728585.5959695.0728697玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌120848485870096.61208489金黃色葡萄球菌1208585.5908996

16、.112086880大腸埃希菌1208283.5898796.01208585 通過連續(xù)三批次不同種菌類的加樣，回收率均在90%以上，說明本產(chǎn)品對于細菌、霉菌及酵母菌不具備抑菌性。3.2控制菌3.2.1大腸埃希菌取10 ml供試液（制備方法同）及大腸埃希菌菌懸液1ml(10100cfu)加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml，于35培養(yǎng)24小時。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時、24小時在366nm紫外燈下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液。紫外燈照射時管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性

17、；加入靛基質(zhì)試液時液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。3.2.2沙門氏菌取10 ml供試液（制備方法同）及乙型副傷寒沙門菌1ml(10100cfu)，直接接種至200ml的營養(yǎng)肉湯培 養(yǎng)基中，混勻，于35培養(yǎng)培養(yǎng)24小時，取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，35培養(yǎng)24小時后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基和曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基的平板上，35培養(yǎng)24小時。3.3合格標準若上述試驗檢測出試驗菌，則按此供試液制備方法和控制菌檢查方法進行供試品的該控制菌檢查。控制菌抑菌性檢查大腸埃希菌試驗組（+/-）陰性對照組（+/-）MUG+ +- -靛基質(zhì)+ +- -沙門氏菌試驗組（+/-）陰性對照組（+/-）四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基+ +- -膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基 + +- -曙紅亞甲藍瓊脂對照培養(yǎng)基+ +- -三糖鐵瓊脂對照培養(yǎng)基+ +- -經(jīng)控制菌的驗證，當樣品被1:10稀釋時，本品不具有抑菌性，可以直接采用平皿法進行檢驗而不對檢測結(jié)果造成假陰性的影響。五、本品微生物限度檢查方法的確定綜上所述，本品細菌、霉菌及酵母菌檢查采用常規(guī)平皿法