cDNA文庫(kù)構(gòu)建策略及其分析研究進(jìn)展

1、自20世紀(jì)70年代中期首例 cDNA 克隆問世以來，構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)已成為研究功能基因組學(xué)的基本手段之一。cDNA 便于克隆和大量表達(dá)，它不像基因組含有內(nèi)含子而難于表達(dá)，因此可以從 cDNA 文庫(kù)中篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達(dá)。通過構(gòu)建 cDNA 表達(dá)文庫(kù)不僅可保護(hù)瀕危珍惜生物資源，而且可以提供構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜的所用探針，更重要的是可以用于分離全長(zhǎng)基因進(jìn)而開展基因功能研究。因此，cDNA 在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方便具有特殊的優(yōu)勢(shì)，從而使它在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)

2、值，是研究工作中最常使用到的基因文庫(kù)。 從1976年 HOFSTETTER 成功的構(gòu)建了第一個(gè) cDNA 文庫(kù)以來，構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)的技術(shù)方法經(jīng)歷了一個(gè)逐步發(fā)展完善的過程。初期 cDNA 文庫(kù)，由于當(dāng)時(shí)技術(shù)的限制，選用質(zhì)粒載體存在著連接效率低、難以擴(kuò)增和保存等缺點(diǎn)，而 YOUNG 和 DAVIS 重組載體為表達(dá)性文庫(kù)構(gòu)建和保存提供了質(zhì)的飛躍。近年來，cDNA 文庫(kù)構(gòu)建的新方法層出不窮，但其共同目的是使 cDNA 文庫(kù)更加迅速、高效滿足研究的需要。本文就近年來發(fā)展的 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建及其類型特點(diǎn)作一簡(jiǎn)要綜述。 1 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建 1.1 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建的基本原理與方法 cDNA

3、 文庫(kù)是指某生物某發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經(jīng)典 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給所合成的 cDNA 加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫(kù)。其基本步驟包括：RNA 的提取(例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍有機(jī)溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定)，要構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的 cDNA 文庫(kù)，獲得高質(zhì)量的 mRNA 是至關(guān)重要的，所以處理 mRNA 樣品時(shí)必須仔細(xì)小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個(gè)無 RNA

4、酶的環(huán)境對(duì)于制備優(yōu)質(zhì) RNA 很重要。在獲得高質(zhì)量的 mRNA 后，用反轉(zhuǎn)錄酶 Oligo(dT) 引導(dǎo)下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成(用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時(shí)包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進(jìn)行的修復(fù)反應(yīng))，合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴(kuò)增 cDNA 文庫(kù)、對(duì)建立的 cDNA 文庫(kù)進(jìn)行鑒定。這里強(qiáng)調(diào)的是對(duì)載體的選擇，常規(guī)用的是 噬菌體，這是因?yàn)?DNA 兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。 1.2 cDNA 全長(zhǎng)文庫(kù)

5、 經(jīng)典 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建雖然高效、簡(jiǎn)便，但文庫(kù)克隆的片段一般較小，單個(gè)克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要幾個(gè)克隆才能覆蓋一個(gè)完整的全基因的 cDNA。為了克隆到真正的 cDNA 全長(zhǎng)，建立富含全長(zhǎng)的 cDNA 文庫(kù)具有重要意義。為此，必須克服僅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆轉(zhuǎn)錄酶作用特點(diǎn)所導(dǎo)致的局限性。全長(zhǎng) cDNA 文庫(kù)，是指從生物體內(nèi)一套完整的 mRNA 分子經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而得到的 DNA 分子群體，是 mRNA 分子群的一個(gè)完整的拷貝。全長(zhǎng) cDNA 文庫(kù)不僅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通過基因序列比對(duì)得到 mRNA 剪接信息，此外，還

6、可以對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)及進(jìn)行體外表達(dá)和通過反向遺傳學(xué)研究基因的功能等。目前所報(bào)道的對(duì)全長(zhǎng)文庫(kù)的構(gòu)建一般按照美國(guó) CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 試劑盒 (Invitrogen，USA) 使用說明進(jìn)行。判斷一個(gè) cDNA 文庫(kù)中的 cDNA 序列是否是全長(zhǎng)基因的 cDNA，主要方法有以下幾種。 1.2.1 直接從序列上評(píng)價(jià) 5'端：如果有同源全長(zhǎng)基因的比較，可以通過與其它生物已知的對(duì)應(yīng)基因5'末端進(jìn)行比較來判斷。如果無同源基因的新基因，則首先判斷編碼框架是否完整，即在開放閱讀框的第1個(gè)

7、 ATG 上游有無同框架的終止密碼子；其次，判斷是否有轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，一般加在5'帽結(jié)構(gòu)后有一段富含嘧啶的區(qū)域，或者是 cDNA 5'序列與基因組序列中經(jīng)過酶切保護(hù)的部分相同，則可以確定得到的 cDNA 的5'端是完整的。3'端：同樣可以用其它生物已知的對(duì)應(yīng)基因3'末端進(jìn)行比較來判斷，或編碼框架的下游有終止密碼子，或有1個(gè)以上的 PolyA 加尾信號(hào)，或無明顯加尾信號(hào)的則也有 PolyA 尾。 1.2.2 用實(shí)驗(yàn)方法證實(shí) 可以通過引物延伸法確定5'端和3'端的長(zhǎng)度，如：5'端 RACE，3'端 RACE，或者通過 Northe

8、rn Blot 證實(shí)大小是否一致。 1.3 對(duì) cDNA 文庫(kù)的分析 對(duì) cDNA 文庫(kù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)主要有兩個(gè)方面。第一方面為文庫(kù)的代表性，cDNA 文庫(kù)的代表性是指文庫(kù)中包含的重組 cDNA 分子反映來源細(xì)胞中表達(dá)信息(即 mRNA 種類)的完整性，它是體現(xiàn)文庫(kù)質(zhì)量的最重要指標(biāo)。文庫(kù)的代表性好壞可用文庫(kù)的庫(kù)容量來衡量，它是指構(gòu)建的原始 cDNA 文庫(kù)中所包含的獨(dú)立的重組子克隆數(shù)。庫(kù)容量取決于來源細(xì)胞中表達(dá)出的 mRNA 種類和每種 mRNA 序列的拷貝數(shù)，1個(gè)正常細(xì)胞含1000030000種不同的 mRNA，按豐度可分為低豐度、中豐度和高豐度三種，其中低豐度 mRNA 是指某一種在細(xì)胞總計(jì)數(shù)群

9、中所占比例少于0.5時(shí)。滿足最低要求的 cDNA 文庫(kù)的庫(kù)容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 計(jì)算( P 為文庫(kù)中任何一種 mRNA 序列信息的概率，通常設(shè)為99；N 為文庫(kù)中以 P 概率出現(xiàn)細(xì)胞中任何一種 mRNA 序列理論上應(yīng)具有的最少重組子克隆數(shù)；n 為細(xì)胞中最稀少的 mRNA 序列的拷貝數(shù)；T 為細(xì)胞中表達(dá)出的所有 mRNA 的總拷貝數(shù))。第二方面是重組 cDNA 片段的序列完整性。在細(xì)胞中表達(dá)出的各種 mRNA 片段的序列完整性。在細(xì)胞中表達(dá)出的各種 mRNA 盡管具體序列不同，但基本上都是由3部分組成，即5'端非翻譯區(qū)，中間的編碼

10、區(qū)和3'端非翻譯區(qū)。非翻譯區(qū)的序列特征對(duì)基因的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用，編碼序列則是合成基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)模板。因此，要從文庫(kù)中分離獲得目的基因完整的序列和功能信息，要求文庫(kù)中的重組 cDNA 片段足夠長(zhǎng)以便盡可能地反應(yīng)出天然基因的結(jié)構(gòu)。 2 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建的其它類型 2.1 均一化 cDNA 文庫(kù) 它是指某一特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因均包含其中，且在 cDNA 文庫(kù)中表達(dá)基因?qū)?yīng)的 cDNA 的拷貝數(shù)相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通過基因組 DNA 飽和雜交的原理將 cDNA 文庫(kù)進(jìn)行均一化的理論。但該理論一直以來都被認(rèn)為不能應(yīng)用于實(shí)際。其主要限制因素是難以提供足量的極

11、低表達(dá)豐度的 cDNA 用于飽和雜交，從而可能會(huì)造成部分基因的 cDNA 的丟失。20年前，基于 DNA-RNA 雜交的研究就已經(jīng)將基因的轉(zhuǎn)錄水平分為高中低3類。隨后研究進(jìn)一步表明，絕大多數(shù)基因是處于中等或低等表達(dá)豐度的，在單個(gè)細(xì)胞中含有近115個(gè)拷貝，而高豐度表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在單個(gè)細(xì)胞中最高可達(dá)5000個(gè)左右拷貝，約占總表達(dá)量的25。這種基因表達(dá)能力上的巨大差異成了獲得一個(gè)具有完整代表性的 cDNA 文庫(kù)的障礙，其表達(dá)量上的巨大差異更為大規(guī)模研究增添了困難。對(duì)單一組織的 cDNA 文庫(kù)而言，高拷貝基因序列的大量存在給基因的篩選和鑒定帶來不必要的浪費(fèi)，尤其是在大規(guī)模的 EST 測(cè)序中。 均一

12、化 cDNA 文庫(kù)是克服基因轉(zhuǎn)錄水平上巨大差異給文庫(kù)篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利于研究基因的表達(dá)和序列分析。現(xiàn)在，在構(gòu)建均一化的 cDNA 文庫(kù)中至少有2種主要的觀點(diǎn)：一種是基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)的原理，高豐度的 cDNA 在退火條件下復(fù)性的速度快，而低豐度的 cDNA 復(fù)性要很長(zhǎng)時(shí)間，從而可以通過控制復(fù)性時(shí)間來降低豐度；另一種是基于基因組 DNA 在拷貝數(shù)上具有相對(duì)均一化的性質(zhì)，通過 cDNA 與基因組 DNA 飽和雜交而降低在文庫(kù)中高拷貝存在的 cDNA 的豐度。第一種方法的掌握對(duì)技術(shù)的要求比較高，對(duì)多數(shù)人而言需要多次摸索才能找到最適條件；而后一種方法易于掌握，但有研究者根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)的原理

13、也提出了其不利因素，即采用基因組 DNA 飽和雜交的方法會(huì)因?yàn)榈涂截惖谋磉_(dá)基因拷貝數(shù)少而無法被雜交上。目前已報(bào)到的均一化 cDNA 文庫(kù)多是根據(jù)第二種原理構(gòu)建的，常用策略有基于 PCR 技術(shù)利用 cDNA 多次復(fù)性 mRNA-cDNA 雜交等。有研究報(bào)道，針對(duì)各自選擇的高表達(dá)靶序列進(jìn)行分析后，均一化處理后文庫(kù)的高豐度表達(dá) cDNA 是處理前的0.32.5，基本滿足節(jié)約篩選的要求。 均一化 cDNA 文庫(kù)具有以下4方面的優(yōu)點(diǎn)：第一，在經(jīng)濟(jì)上具有廣泛的應(yīng)用空間，可以節(jié)約大量試驗(yàn)成本。第二，增加克隆低豐度 mRNA 的機(jī)會(huì)，適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達(dá)及突變檢測(cè)。第三，與原始豐度的 m

14、RNA 拷貝數(shù)相對(duì)應(yīng)的 cDNA 探針與均一化的 cDNA 文庫(kù)作雜交，可以估計(jì)出大多數(shù)基因的表達(dá)水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫(kù)構(gòu)建，忽略了 mRNA 豐度的影響。第四，可以用于遺傳圖譜的制作和進(jìn)行大規(guī)模的原位雜交，作為優(yōu)化的文庫(kù)系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測(cè)序或芯片制作等研究。 2.2 差減 cDNA 文庫(kù) (Subtractive cDNA library) 差減文庫(kù)也稱扣除文庫(kù)，使用兩種遺傳背景相同或大致相同但在個(gè)別功能或特性上不同的材料(如不同基因處理細(xì)胞系或植物的近等基因系等)提取 mRNA (或反轉(zhuǎn)錄后合成 cDNA)，在一定條件下用大大過量不含目的基因的一方作為驅(qū)動(dòng)子( D

15、river )與含有目的基因的試驗(yàn)方( Tester )進(jìn)行雜交，選擇性的祛除兩部分共同基因雜交形成的復(fù)合物，往往進(jìn)行多次的雜交祛除過程，最后將含有相關(guān)目的基因的未雜交部分收集后，并連接到載體形成文庫(kù)。消減雜交是構(gòu)建差減 cDNA 文庫(kù)的核心，差減文庫(kù)是否構(gòu)建成功很大程度上決定于差減雜交的效率。差減雜交的方法主要有(1)羥基磷灰石柱層析法 (HAP)；(2)生物素標(biāo)記、鏈親和蛋白結(jié)合排除法；(3)限制性內(nèi)切酶技術(shù)相結(jié)合的差減方法；(4)差減抑制雜交法 (SSH)；(5)磁珠介導(dǎo)的差減法 (MAST)，其中 SSH 法最為常用。 抑制性消減雜交技術(shù) (Suppression Subtractiv

16、e Hybridization，SSH) 是 DIATCHENKO 等人于1996年依據(jù)消減雜交和抑制 PCR 發(fā)展出來的一種分離差異表達(dá)基因的新方法，主要用于分離兩種細(xì)胞或兩種組織的細(xì)胞中的差異表達(dá)基因。它主要是利用抑制 PCR 對(duì)差減雜交后豐度一致的目的材料中兩端連有不同接頭的差異表達(dá)片段進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，而兩端連接上同一接頭的同源雙鏈片段僅呈線形擴(kuò)增，從而達(dá)到富集差異表達(dá)基因的目的。因此應(yīng)用該技術(shù)能夠?qū)蓚€(gè)有差異表達(dá)的材料(細(xì)胞或組織)高、中、低豐度目的基因都進(jìn)行有效、快速、簡(jiǎn)便克隆。近年來已成功應(yīng)用于植物發(fā)育、腫瘤與疾病、以及外界因子誘導(dǎo)組織細(xì)胞中相關(guān)的應(yīng)答基因的分析和克隆。 2.3 固相

17、 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建 cDNA 的固相合成是人們?cè)鐬槭熘募夹g(shù)，但局限之處 oligo(dT) 與纖維素膠粒或磁珠的結(jié)合比較牢固，將 cDNA 洗脫下來時(shí)得率不是很高，而且以后的反應(yīng)步驟也不能都在介質(zhì)上進(jìn)行，這可能是該技術(shù)應(yīng)用并不十分廣泛的原因。 最近 THOMAS ROEDE 提出了一種新的 cDNA 文庫(kù)固相合成方法( THOMAS ROEDE，1998)，克服了以前文庫(kù)構(gòu)建中存在的缺點(diǎn)，所用的酶和試劑與傳統(tǒng)方法完全相同，不同的是 cDNA 的合成和修飾均在固相支持物磁珠上完成。cDNA 通過一個(gè)生物素固定在鏈霉素偶聯(lián)的磁珠上，這樣在反應(yīng)過程中就可以簡(jiǎn)便而迅速的實(shí)現(xiàn)酶和緩沖液的更換，因此它

18、將快速與高質(zhì)量的文庫(kù)構(gòu)建結(jié)合在一起(構(gòu)建文庫(kù)只需1 d)，并且構(gòu)建的文庫(kù)適合大多數(shù)的研究目的。 固相 cDNA 合成法的主要優(yōu)點(diǎn)是可以簡(jiǎn)便 cDNA 合成的操作。在進(jìn)行緩沖液更換時(shí)既沒有 cDNA 的丟失之憂，也無其它物質(zhì)污染之憂。另外，用此方法可以得到真實(shí)的代表性文庫(kù)，它包含有短小的 cDNA，這是因?yàn)樵诳寺≈笆∪チ朔旨?jí)分離的步驟。總之，固相法結(jié)合了傳統(tǒng)的 cDNA 合成的優(yōu)點(diǎn)并彌補(bǔ)了其不足。這種方法簡(jiǎn)便易行，可靠低廉，所建文庫(kù)高質(zhì)量，因此它可能會(huì)替代目前應(yīng)用的 cDNA 文庫(kù)操作方法。 另外，最近發(fā)展起來的微量 RNA 的 cDNA 構(gòu)建，是使用 PCR 技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室條件下擴(kuò)增的 mR

19、NA 的 cDNA 量，其 PCR 檢測(cè)的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于反轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR) 法。微量 RNA 的 cDNA PCR 文庫(kù)的構(gòu)建可為有關(guān)微量活性物質(zhì)遺傳基因的研究提供方便。 3 cDNA 文庫(kù)應(yīng)用于分離新基因的方法 發(fā)現(xiàn)并分離克隆新基因始終是分子生物學(xué)研究的主要任務(wù)和目的，雖然 cDNA 文庫(kù)的用途很多，但是，應(yīng)用于分離新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪種類型的 cDNA 文庫(kù)，都可以用于分離新基因，只是使用的方法有差異。分離方法主要有兩種：第一，對(duì)于非全長(zhǎng) cDNA 文庫(kù)，即不管是經(jīng)典的 cDNA 文庫(kù)方法或差減法構(gòu)建的 cDNA 文庫(kù)，需要利用已經(jīng)獲得的新 cDNA 序列片段

20、，通過 RACE 方法獲得新基因的全長(zhǎng)序列。第二，利用全長(zhǎng) cDNA 文庫(kù)與目的基因片段作為探針的雜交篩選。 3.1 從非全長(zhǎng) cDNA 文庫(kù)中篩選新基因 3.1.1 RACE 法 RACE 文庫(kù)即快速擴(kuò)增 cDNA 末端法( Rapid Amplification of cDNA End，RACE )只需知道 mRNA 內(nèi)很短的一段序列即可擴(kuò)增出其 cDNA 的5'(5' RACE )和3'端(3' RACE )。該法的主要特是利用一條根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的特異性引物和一條與 mRNA 的 PolyA (3' RACE )或加至第一鏈 cDNA 3'

21、;端的同聚尾(5' RACE )互補(bǔ)的通用引物，由于同聚體并非良好的 PCR 引物，同時(shí)為了便于 RACE 產(chǎn)物的克隆，可向同聚體引物的5'端內(nèi)加入一內(nèi)切酶位點(diǎn)。所用的 cDNA 模板可以使用多聚 dT 引物延伸合成(3'，5'-RACE 均可)。當(dāng) RACE PCR 產(chǎn)物為復(fù)雜的混合物時(shí)，可取部分產(chǎn)物作模板，用另一條位于原引物內(nèi)側(cè)的序列作為引物與通用引物配對(duì)進(jìn)行另一輪 PCR (巢式 PCR )。早在1988年，F(xiàn)ROHMAN 等即用此方法成功地獲得了4種 mRNA 的5'合3'末端序列。 迄今已有幾種改良的 RACE 方法，通過修飾與優(yōu)化，與

22、最初的 FROHMAN 報(bào)道有所不同：(1) BARSON 等采用鎖定寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸引物“鎖定”基因特異性序列的3'末端與其 Poly (A) 尾的連接處，進(jìn)行第1條 cDNA 鏈的合成，消除了在合成第1條 cDNA 鏈時(shí)寡聚 (dT) RNA 模板 Poly (A) 尾任何部位結(jié)合而帶來的影響。(2) EDWARDS 和 TROUTT 小組利用 T4 RNA 連接酶把寡核苷酸連接到單鏈 cDNA 的5'末端，然后用一個(gè)3'末端特異性引物和一個(gè)錨定引物就可以直接對(duì)錨定連接的 cDNA 進(jìn)行體外 PCR 擴(kuò)增和克隆。隨后，BERTLING 等又用 DNA 連接酶代

23、替 RNA 連接酶。這些方法都避免了在第2條 cDNA 鏈內(nèi)同聚序列區(qū)互補(bǔ)而導(dǎo)致截?cái)?cDNA 的產(chǎn)生。(3) MARUYAMA 等提出 cRACE 法，采用的引物為基因特異性的，所以非特異性 PCR 產(chǎn)物基本上不會(huì)產(chǎn)生。Clontech 等公司也根據(jù) RACE 法的更新，相繼推出了 RACE 的相應(yīng)試劑盒，為克隆 cDNA 提供了方便的工具。最近 HUANG 等人即用 RACE 試劑盒克隆了一種含有類植物血凝素免疫受體 ITIM。 3.1.2 用 PCR 法從 cDNA 文庫(kù)中快速克隆基因 通過對(duì)文庫(kù)的篩選或適用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，常常只能獲得不完整的 cDNA 片段。為了得到 cD

24、NA 全長(zhǎng)，常常要重新篩選文庫(kù)。重新篩選文庫(kù)工作量大，RACE 雖然為此提供可方便，但應(yīng)用該方法需重新提取 mRNA 和反轉(zhuǎn)錄。而用 PCR 法從 cDNA 文庫(kù)中快速克隆基因的方法，只需提取 噬菌體 DNA，按保守序列設(shè)計(jì) PCR 引物便可將未知片段進(jìn)行克隆。特別是在基因的兩端變異較大而中間某區(qū)域保守的情況下，用 PCR 法很容易獲取 cDNA 的全長(zhǎng)。同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，又是存在著不同的拼接方式，通過篩庫(kù)的辦法同時(shí)將不同拼接方式的克隆篩選出來可能性較小，而使用 PCR 擴(kuò)增后，有利于觀察到不同的拼接方式。另外，為研究基因在不同組織中表達(dá)情況，常根據(jù)差異顯示法找出特異的 mRNA。 3.2 從全長(zhǎng) cDNA 文庫(kù)中進(jìn)行雜交篩選 3.2.1 標(biāo)記探針 cDNA 文庫(kù)篩選法 cDNA 文庫(kù)通常涂抹到母盤培養(yǎng)基上，然后再把這些菌落的樣品吸印到硝酸纖維素膜或尼龍膜上；這時(shí)加入標(biāo)記的探針，如果出現(xiàn)雜交信號(hào)，那么從母盤上就可以把包含雜交信號(hào)的菌落分離、培養(yǎng)出來。以此篩選出陽(yáng)性克隆，進(jìn)行序列分析，以獲得 cDNA 全長(zhǎng)。該方法能避免 PCR 擴(kuò)增的非特異性擴(kuò)增或錯(cuò)配，是一種比較準(zhǔn)確可靠的 cDNA 克隆方法。主要缺點(diǎn)是克隆過程需要一系列的酶促反應(yīng)、產(chǎn)